Avaliação da expressão de genes relacionados à biossíntese de lipooligossa- carídeo (LOS) na cepa vacinal de Bordetella pertussis do Instituto Butantan


Abstract
Pertussis is a highly contagious respiratory disease caused by the Gram-negative bacterium Bordetella pertussis, which, although preventable by vaccination, still represents a public health problem today. Among the vaccines available, there are formulations with inactivated whole bacteria (wP) that generate lasting immunity, but may present adverse effects, and acellular formulations (aP), containing purified antigens and associated with milder adverse effects, but less lasting immunity. The adverse effects that may occur in wP were attributed to Lipooligosaccharide (LOS), present in outer membrane of B. pertussis. It is known that the structure of LOS can vary between strains and also that is a variation in the activation of TLR-4, which can lead to differences in the reactogenicity of vaccines. In 2015, the genomic sequencing of the vaccine strain of B. pertussis (Bp137) allowed the characterization of the Brazilian pertussis vaccine strain and the main genes related to the LOS synthesis pathway and some genes related to changes in Lipid A were described. “In silico” mapped genes whose products are linked to modifications in the acylated chains or in the phosphate group of Lipid A, such as pagL and pagP, and the lgm locus, related to the addition of glucosamine to the phosphate groups. These changes can lead to a greater or lesser activation of TLR-4 and production of cytokines, modulating the immune response. In this sense, the objective of this work was to deepen the characterization studies of the LOS of Bp137 to confirm whether the modifications found "in silico" actually occur in some in vivo condition, through the evaluation of the lgmA, pagP, pagL and waaC genes, related to the synthesis and modification of the LOS. The pertussis vaccine production strain Bp137 was cultivated on a laboratory scale, and accompanied by the in-process control steps commonly performed for the production of the pertussis vaccine. The pertussis vaccine production strain Bp137 was cultivated on a laboratory scale, and accompanied by the in-process control steps commonly performed for the production of the pertussis vaccine. From this culture, the extraction of total RNA was carried out, its concentration and purity were determined, for analysis of gene expression by conventional PCR and Real Time PCR. Bacterial growth was evidenced by Opacity and Optical Density; the specificity by purity tests, agglutinogens and Western blot of PT and FHA virulence factors. RNA with reasonable quality was obtained for gene expression analysis experiments and there was no genomic DNA. In the amplification of cDNA of Bp137, the amplification of the lgmA, pagP, pagL and waaC genes was observed, indicating that these genes are possibly expressed in Bp137. The Real Time PCR reactions confirmed the expression of lgmA in the Bp137 strain. As a future perspective, the expression by Real Time PCR for the target genes pagP, pagL and waaC should be confirmed. The results indicate that these genes are possibly ex- pressed in the Bp137 strain, but further studies are needed to obtain such confirmation. The characterization of B. pertussis LOS becomes even more important due to the possibility of using Lipid A as a vaccine adjuvant or even for future interventions to reduce vaccine reactogenicity.
Abstract in Portuguese
A coqueluche é uma doença respiratória altamente contagiosa causada pela bactéria Gram-negativa Bordetella pertussis, que embora seja prevenível por vacinação, ainda hoje representa um problema de saúde pública. Dentre as vacinas disponíveis, há formulações com bactérias inteiras inativadas (wP) que geram imunidade duradoura, mas podem apresentar efeitos adversos, e formulações acelulares (aP), contendo an-tígenos purificados e associada a efeitos adversos mais leves, mas imunidade menos duradoura. Os efeitos adversos que podem ocorrer nas wP foram atribuídos ao Lipo-oligossacarídeo (LOS), presente na membrana externa de B. pertussis. Sabe-se que a estrutura do LOS pode variar entre cepas e também que há uma variação da ativa-ção de TLR-4, o que pode levar a diferenças na reatogenicidade das vacinas. Em 2015 o sequenciamento genômico da cepa vacinal de B. pertussis (Bp137) permitiu a caracterização da cepa produtora da vacina pertussis Brasileira e foram descritos os principais genes relacionados a via de síntese do LOS e alguns genes relacionados a modificações no Lipídio A. As análises “in silico” mapearam genes cujos produtos es-tão ligados a modificações nas cadeias aciladas ou ainda no grupo fosfato do Lipídio A, tais como pagL e pagP, e o locus lgm, relacionado a adição de glucosamina nos grupos fosfatos. Essas alterações podem levar a uma maior ou menor ativação de TLR-4 e produção de citocinas, modulando a resposta imune. Nesse sentido, objeti-vou-se com este trabalho aprofundar os estudos de caracterização do LOS da Bp137 para confirmar se as modificações encontradas “in silico” ocorrem de fato em alguma condição in vivo, através da avaliação dos genes lgmA, pagP, pagL e waaC, relacio-nados à síntese e modificação do LOS. A cepa de produção da vacina pertussis Bp137 foi cultivada em escala laboratorial, acompanhada das etapas de controle em processo comumente realizadas para a produção da vacina pertussis. A partir deste cultivo realizou-se a extração de RNA total, determinou-se sua concentração e pureza, para análise de expressão gênica por PCR convencional e PCR Em Tempo Real. O crescimento bacteriano foi evidenciado por meio da Opacidade e Densidade óptica; a especificidade pelos testes de pureza, aglutinógenos e Western Blot dos fatores de virulência PT e FHA. Obteve-se RNA com qualidade razoável para experimentos de análise de expressão gênica e verificou-se ausência de DNA genômico. Na amplificação de cDNA de Bp137, foi observada a amplificação dos genes lgmA, pagP, pagL e waaC, indicando que possivelmente estes genes estejam expressos na Bp137. As reações de PCR em Tempo Real confirmaram a expressão do lgmA na cepa Bp137. Como perspectiva futura deverá ser confirmada a expressão por PCR em Tempo Real para os genes alvo pagP, pagL e waaC. Os resultados indicam que possivelmente estes genes estejam expressos na cepa de Bp137, porém são necessários mais estudos para obter tal confirmação. A caracterização das LOS de B. pertussis se torna ainda mais importante ainda pela possibilidade do uso do Lipídio A como adjuvante vacinal ou ainda de futuras intervenções para redução da reatogenicidade vacinal.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/4169
Issue Date
2022


Files in This Item:

Existing users please Login
TCC Lucas Donega .pdf
Description:
Size: 1.83 MB
Format: Adobe PDF
Embargoed until January 1, 2099    Request a copy
Apresentação TCC - Lucas Donegá.mpg
Description:
Size: 281.52 MB
Format: MPEG
Embargoed until January 1, 2099    Request a copy
Show full item record

The access to the publications deposited in this repository respects the licenses from journals and publishers.