Estudo da influência da secreção cutânea do anfíbio Rhinella diptycha (Rhinella schneideri) sobre o processo de formação in vitro de osteoclastos


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Thesis
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Portuguese
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Abstract
Osteoclasts (OCs) are multinucleated cells, specialized in reabsorbing calcified bone matrix. OCs are derived from hematopoietic precursor cells and can be generated in vitro by stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the cytokines M-CSF and RANKL. Abnormal activation of OCs occurs in pathologies such as osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, periodontal disease, Paget's disease, metastatic cancers and others, causing morbidity and promoting physical limitations. Chronic inflammation leads to the secretion of many pro-inflammatory cytokines and RANKL among them. These cytokines are primarily responsible for osteoclast activation and subsequent bone destruction. Poisoning, caused by different animal species (bees, frogs, scorpions, snakes, etc.), is also known to induce a local and acute inflammatory process. The effect of the venoms of these animals on the differentiation, maturation and degeneration of OCs is unknown. To improve the understanding of the physiology of OCs, and a possible interference in their formation and function processes, we used a model of differentiation from human PBMCs. PBMCs were induced for osteogenic differentiation using the routine protocol. Then we treated the PBMCs with the cutaneous secretion of the amphibian Rhinella dypticha (Rhinella schneideri) to evaluate its effect on the OC differentiation process, which can be divided into three stages, pre-osteclasts, OCs and mature multinucleated OCs. When we used amphibian skin secretion at concentrations of 25 ng/mL and 2.5 ng/mL, we observed a statistically significant decrease in the viability of these cells. Additionally, we showed that the lower concentrations of 0.25 ng/mL and 0.125 ng/mL, although not toxic, induced a decrease in the formation of OCs, which was evidenced by a positive Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP), which is a marker of OCs. mature. With the labeling with Phalloidin conjugated, we saw that the concentration of 0.25 ng/mL affected the formation of multinucleated OCs due to the decrease in the number of cells with 2 and 3 - 5 nuclei. The results obtained suggest the presence of molecules in the cutaneous secretion of Rhinella diptycha that influence the differentiation of OCs in vitro, decreasing the formation of TRAP-positive OCs – mature and affecting the process of formation of multinucleated OCs with 2 to 5 nuclei.
Abstract in Portuguese
Os osteoclastos (OCs) são células multinucleadas, especializadas em reabsorver a matriz óssea calcificada. OCs se derivam de células precursoras hematopoiéticas e podem ser gerados in vitro pela estimulação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com as citocinas M-CSF e RANKL. Ativação anormal dos OCs ocorre em patologias como osteoporose, artrite reumatoide, osteoartrite, doença periodontal, doença de Paget, cânceres metastáticos e outras, causando morbidade e promovendo limitações físicas. A inflamação crônica leva à secreção de muitas citocinas pró-inflamatórias e RANKL entre elas. Estas citocinas são as principais responsáveis pela ativação dos osteoclastos e subsequente destruição óssea. O envenenamento, causado por diferentes espécies animais (abelhas, rãs, escorpiões, cobras etc.), é conhecido também por induzir um processo inflamatório local e agudo. O efeito dos venenos destes animais na diferenciação, maturação e degeneração dos OCs é desconhecido. Para melhorar a compreensão da fisiologia dos OCs, e de uma possível interferência em seus processos de formação e função, utilizamos um modelo de diferenciação a partir das PBMCs humanas. As PBMCs foram induzidas para diferenciação osteogênica utilizando o protocolo de rotina. Em seguida tratamos as PBMCs com a secreção cutânea do anfíbio Rhinella dypticha (Rhinella schneideri) para avaliar o seu efeito no processo de diferenciação dos OCs que pode ser dividida em três fases, pré- osteclastos, OCs e OCs maduros multinucleados. Quando utilizamos a secreção cutânea do anfíbio nas concentrações de 25 ng/mL e 2,5 ng/mL observamos a diminuição estatisticamente significativa na viabilidade dessas células. Adicionalmente mostramos que, as concentrações mais baixas de 0,25 ng/mL e 0,125 ng/mL embora não tenham sido tóxicas induziram a diminuição de formação dos OCs que foi evidenciado pela Fosfatase Acida Resistente ao Tartarato (TRAP) positivo que é um marcador de OCs maduros. Já com a marcação com Faloidina conjugada, vimos que a concentração de 0,25 ng/mL afetou a formação dos OCs multinucleadas devido a diminuição do número de células de 2 e de 3 - 5 núcleos. Os resultados obtidos sugerem a presença de moléculas na secreção cutânea de Rhinella diptycha que influenciam a diferenciação de OCs in vitro diminuindo a formação dos OCs TRAP positivas – maduras e afetam o processo de formação das OCs multinucleadas de 2 a 5 núcleos.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/5204
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2023


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