Expressão da proteína recombinante Sm29 em Escherichia coli e purificação a partir dos corpúsculos de inclusão


Abstract
Schistosomiasis is a neglected chronic parasitic tropical disease caused by the trematode worm Schistosoma spp., common in developing countries. Pharmacological treatments are available, but they are not effective due to the global epidemiological situation. A preventive vaccine could effectively contribute to reduce the infection. Among a number of antigens, the tegumental protein Sm29 from adult worm Shistosoma mansoni has been identified as a promising vaccine candidate. The gene Sm29 was cloned with 393 nucleotides, excluding a signal peptide and the transmembrane domain, to express the protein with 130 amino acids, approximately 18 kDa, with theoretical pI 6.5. Our objectives is to obtain the recombinant Sm29 protein expressed in Escherichia coli without histidine tag. Therefore, we must optimize the Sm29 obtaining processe, upstream and downstream, in order to design the industrial process, improving the yield and quality of the product to be used in clinical trials. Cells of E. coli BL21(DE3)_pET28_Sm29 were cultivated in bioreactor for Sm29 expression and they were separated by centrifugation. The cells were resuspended in buffer and lysed in French Press. The inclusion bodies (IB) were recovered by centrifugation and we studied the clarification of IB by washing with different solutions and using different centrifugation forces. The solubilization of IB was tested with 8 M Urea under different pH conditions. After the treatments, the protein profiles were analyzed by SDS-PAGE, to verify the presence of the expected band of ~18 kDa and the removal of contaminants. The washing solutions and the lower centrigugation speed helped to clarify the material, without causing losses. The pH of the solubilization solutions interfere with protein recovery, determining to work above pH 7.5, to seek the best balance between protein recovery and contaminant elimination. To meet regulatory requirements in the industrial process for vaccine production, we aim to replace purification by metal affinity chromatography (IMAC), allowed by the presence of the his-tag, added to the antigen as a purification strategy. Thus, the purification of rSm29 by IMAC was compared with studies of ion exchange chromatography, evaluating the binding of denatured or renatured proteins to the resins. It was found that the initial IB clarification parameters and solubilization conditions interfere in the chromatography and dialysis stages. It was determined that. to date. the best condition of binding is the renatured protein to the anion exchange resin, Q-Sepharose. As we identified an alternative purification method, we cloned the Sm29 gene without the his tag code to express the protein in BL21(DE3). Furthermore, the Sm29 gene was optimized for E. coli codon usage. The optimized gene was also cloned for expression in BL21(DE3), to evaluate whether it would modify the protein synthesis in terms of amount of expression and solubility. The first tests suggest that the amount of protein expression is similar to that obtained with the original gene. Tests of solubilization by pressurization are planned to analyze whether possible structural modifications in rSm29 may improves protein recovery.
Abstract in Portuguese
A esquistossomose é uma doença tropical parasitária crônica negligenciada, causada pelo verme trematódeo Schistosoma spp., comum em países em desenvolvimento. Os tratamentos farmacológicos disponíveis não são eficazes devido à situação epidemiológica global. Uma vacina preventiva poderia contribuir eficazmente para a reduzir a infecção. Entre uma série de antígenos, a proteína tegumentar Sm29 do verme adulto Shistosoma mansoni foi identificada como uma promissora candidata a vacina. O gene Sm29 foi clonado com 393 nucleotídeos, excluindo um peptídeo sinal e o domínio transmembrana, para expressar a proteína com 130 aminoácidos, aproximadamente 18 KDa, com pI teórico 6,5. Nosso objetivo é obter a proteína Sm29 recombinante expressa em Escherichia coli sem cauda de histidina. Para tanto, devemos otimizar os processos de fermentação dos clones e os processos de purificação, para então, desenhar o processo industrial para melhorar o rendimento e a qualidade do produto a ser utilizado em ensaios clínicos. Células do clone E. coli BL21(DE3)_pET28_Sm29 foram cultivadas em biorreator para expressão de rSm29, separadas por centrifugação, ressuspensas em tampão e lisadas em “French Press”. Os corpos de inclusão (CI) foram recuperados por centrifugação e estudamos a etapa de clarificação dos CI por lavagens com diferentes soluções e forças de centrifugação. Testamos a solubilização dos CI com Ureia 8 M sob diferentes condições de pH. Após os tratamentos, analisamos os perfis proteicos por SDS-PAGE, verificando a banda esperada de ~18 kDa e a remoção de contaminantes. As soluções utilizadas na lavagem e a menor velocidade de centrifugação clarificam o material, sem causar perdas da proteína de interesse. O pH da solução de solubilização interfere na recuperação da proteína, determinando trabalhar com pH acima de 7,5 para buscar o melhor equilíbrio entre recuperação proteica e eliminação de contaminantes. Para atender aos requisitos regulatórios de processo industrial na produção de vacinas, temos o objetivo de substituir a purificação por cromatografia de afinidade a metal (IMAC) para poder remover a cauda de histidina, adicionada ao antígeno como estratégia de purificação. Assim, comparamos a purificação da rSm29 por IMAC com estudos de purificação por trocas iônicas, avaliando a ligação da proteína desnaturada ou renaturada com as resinas. Verificamos que os parâmetros iniciais de clarificação da CI e as condições de solubilização interferem nas etapas de cromatografia e diálise. Determinamos que a melhor condição, até o momento, é a ligação da proteína renaturada à resina de troca aniônica, Q-Sepharose. Identificado um método alternativo de purificação, clonamos o gene Sm29 sem a cauda de histidina e expressamos a proteína em BL21(DE3). Além disso, o gene Sm29 foi otimizado para uso de códons de E. coli. Um gene otimizado foi clonado para expressão em BL21(DE3), para avaliarmos se modificaria a estrutura da proteína durante a síntese da cadeia primária, em termos de quantidade de expressão e solubilidade. Os primeiros testes sugerem que a expressão é semelhante à obtida com o gene original. Testes de solubilização por pressurização estão planejados para analisar se a possível modificação estrutural na rSm29 melhoraria a recuperação do antígeno.
Reference
SILVEIRA, Naiara Domingos da. Expressão da proteína recombinante Sm29 em Escherichia coli e purificação a partir dos corpúsculos de inclusão. 2024. 38 p. Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização em Biotecnologia para a saúde: vacinas e biofármacos) – Escola Superior do Instituto Butantan, São Paulo, 2024.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/5341
Issue Date
2024

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