Avaliação da expressão da proteína recombinante Sm29 de Schistosoma mansoni por Escherichia coli


Publication type
Academic monograph
Language
Portuguese
Access rights
Restricted access
Abstract
Introduction: Sm29 is a tegument protein present in Schistosoma mansoni considered a potential vaccine antigen against schistosomiasis. Previous studies have shown that Sm29 is strongly expressed in E. coli in the form of inclusion bodies, in the presence of inducers such as IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) and lactose. Objective: to evaluate the Sm29 production process using a recombinant strain of E. coli as an expression system. Methodology: Cultivations of the E. coli BL21(DE3) strain were carried out in 500 mL shake flasks cont9aining 100 mL of HCDC defined medium supplemented with Kanamycin (25 mg/mL) as a selective marker. Cultures were conducted at 37°C under shaking at 300 rpm and cell growth was monitored by reading optical density at 600 nm (OD600). Initially, experiments were carried out to evaluate the kinetic behavior, with a rate of 5 ul of bacterial suspension being defined to conduct the induction experiments. IPTG was tested at concentrations of 0.2-10 mM. For experiments using lactose as an inducer, concentrations of 5 g/L and 10 g/L were tested. Experiments were also conducted in a bioreactor, using the two inducing agents. Samples to evaluate protein expression were collected every hour after total glucose consumption. Sm29 expression was determined by SDS-PAGE using 12.5% (w/v) polyacrylamide gels (adjusted to OD600 10). Results: about the optical densities achieved, IPTG appears to have an adverse effect on cell growth, with higher densities (OD600) being observed in experiments with lactose in shaken flasks. Protein expression was obtained regardless of the inducer used, both in shake flasks and in a bioreactor. IPTG or lactose concentrations do not appear to significantly influence the amount of protein expressed, suggesting the feasibility of using lower concentrations to reduce production costs. The evaluation of protein expression in SDS-Page points to a possible higher expression when using IPTG compared to lactose. The methodology applied to bioreactor cultivations, aiming to control the production of acetate, demonstrated effectiveness by maintaining the concentration of this acid at approximately 1 g/L, without observing differences related to the carbon sources or the inducing agent used. Conclusion: we consider that lactose may represent an interesting alternative for protein production and cell yield of Sm29, however additional studies are needed to evaluate the cultivation conditions that impact the total production time, as well as cell density and protein expression, with the aim of optimizing cultivation strategies.
Abstract in Portuguese
Introdução: Sm29 é uma proteína do tegumento presente no Schistosoma mansoni considerada um potencial antígeno vacinal contra a esquistossomose. Estudos anteriores mostraram que o Sm29 é fortemente expressa em E. coli na forma de corpos de inclusão, na presença de indutores como IPTG (isopropil β-D-1- tiogalactopiranosídeo) e lactose. Objetivo: avaliar o processo de produção de Sm29 utilizando cepa recombinante de E. coli como sistema de expressão. Metodologia: Os cultivos da cepa E.coli BL21(DE3) foram realizados em frascos agitados de 500 mL contendo 100 mL de meio definido HCDC suplementado com Canamicina (25 mg/mL) como marcador seletivo. As culturas foram conduzidas a 37°C sob agitação de 300 rpm e o crescimento celular foi monitorado por meio da leitura da densidade óptica a 600 nm (OD600). Inicialmente foram realizados experimentos de avaliação do comportamento cinético, sendo definida a taxa de 5 ul de suspensão bacteriana para a condução dos experimentos de indução. O IPTG foi testado em concentrações de 0,2-10 mM. Para experimentos utilizando lactose como indutor, foram testadas concentrações de 5 g/L e 10 g/L. Também foram conduzidos experimentos em biorreator, utilizando os dois agentes indutores. Amostras para avaliação da expressão proteica foram coletadas a cada hora após o consumo total de glicose. A expressão de Sm29 foi determinada por SDS-PAGE utilizando géis de poliacrilamida a 12,5% (p/v) (ajustado para DO600 10). Resultados: no que se refere às densidades ópticas alcançadas, o IPTG parece exercer um efeito adverso no crescimento celular, sendo observadas maiores densidades (OD600) em experimentos com lactose em frascos agitados. A expressão da proteína foi obtida independente do indutor utilizado, tanto em frascos agitados quanto em biorreator. As concentrações de IPTG ou lactose não parecem influenciar significativamente na quantidade de proteína expressa, sugerindo a viabilidade de utilizar concentrações menores para reduzir o custo de produção. A avaliação da expressão da proteína em SDS-Page aponta para uma possível maior expressão quando se utiliza IPTG em comparação com a lactose. A metodologia aplicada nos cultivos em biorreator, visando controlar a produção de acetato, demonstrou eficácia ao manter a concentração deste ácido em aproximadamente 1 g/L, sem observar diferenças relacionadas às fontes de carbono ou ao agente indutor utilizados. Conclusão: consideramos que a lactose pode representar uma alternativa interessante para a produção proteica e rendimento celular de Sm29, porém são necessários estudos adicionais para avaliar as condições de cultivo que impactam no tempo total de produção, bem como na densidade celular e expressão da proteína, com o intuito de otimizar as estratégias de cultivo.
Reference
FARIA, Gabriela. Evaluation of the expression of the recombinant protein Sm29 from Schistosoma mansoni by Escherichia coli. 2024. 56 p. Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização em Biotecnologia para a Saúde) – Escola Superior do Instituto Butantan, São Paulo, 2024.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/5361
Issue Date
2024

Show full item record

The access to the publications deposited in this repository respects the licenses from journals and publishers.