Caracterização das microvesículas presentes no veneno de Crotalus durissus terrificus

O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), é constituído por toxinas responsáveis pelas complicações clínicas que ocorrem durante o envenenamento, entretanto, estas toxinas não são os únicos componentes presentes no veneno, numerosas microvesículas de conteúdo elétron-denso (40-80 nm de diâmetro) são observadas na face luminal das células secretoras da glândula de veneno, bem como no veneno coletado. Estas estruturas originam-se de microvilos por fragmentação ou brotamento e possuem partículas intramembranosas na face citoplasmática sugerindo a presença de proteínas transmembrânicas. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar as proteínas presentes nas microvesículas do veneno de Cdt, correlacionando suas possíveis funções através de dados já conhecidos na literatura. Em nossos estudos, utilizamos veneno extraído de Cdt, mantidas em cativeiro no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Isolamos as microvesículas do veneno de Cdt através de ultracentrifugações. O Sobrenadante (S2) da primeira ultracentrifugação, veneno sem microvesículas, e o veneno bruto foram utilizados como controles. A análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a morfologia das microvesículas se mantém mesmo após as duas ultracentrifugações. Em eletroforese unidimensional detectamos bandas em torno de 72, 148, 176, 272 e 323 kDa que estão presentes somente no extrato de microvesículas. A análise do perfil protéico em eletroforese bidimensional confirmou a presença de proteínas específicas de microvesículas. Quando S2 foi utilizado como controle, 18 spots foram detectados somente no extrato de microvesículas (spots de180 kDa com pI em torno de 4; spots entre 60 a 70 kDa com pI em torno de 7 a 9; spots de 11 kDa com pI 4; spots de 10 kDa com pI entre 5 a 7 e 9 a 10). Entretanto, quando o veneno bruto foi utilizado como controle, mais 10 spots foram detectados em S2 e extrato de microvesículas (spots de 36 kDa e pI em torno de 5 a 7 e spots de 32 kDa e pI em torno de 9 a 10). A análise por Western blotting, utilizando soro anticrotálico como fonte de anticorpos, mostrou que somente algumas proteínas das microvesículas são reconhecidas. As identificações das proteínas, por espectrometria de massa, mostraram a presença de proteínas de membrana celular e proteínas intracelulares. As proteínas de membrana celular identificadas foram: ecto-5´-nucleotidase, aminopeptidase N e enzima conversora de angiotensina. As proteínas intracelulares identificadas foram: proteína contendo domínios de anquirina, N-acylglucosamine 2-epimerase, proteína com domínios ricos em leucina, domínio imunoglobulina e domínio transmembrânico, isoforma 1 da subunidade alfa do fator de fragmentação de DNA e subunidade regulatória da fosfatase 1. Em conclusão, mostramos que após as ultracentrifugações, as microvesículas mantêm sua morfologia, mas algumas delas são lisadas, visto que mais 10 spots foram identificados em S2 e extrato de microvesículas, mas não no veneno bruto. Além disso, as proteínas identificadas podem fazer parte de vias metabólicas que regulam a integridade da célula secretora bem como ter um papel relevante no envenenamento, de acordo com as funções já descritas em literatura. A participação de microvesículas em processos fisiológicos ou patológicos mostra sua importância e abre novas perspectivas de investigação de seu papel no envenenamento.
Keywords
Crotalus durissus terrificus;  Veneno de serpente;  Proteínas;  Microvesícula;  Glândula de veneno;  Snake venom;  Proteins;  Microvesicles;  Venom gland

Other Titles
Caracterization of the microvescles present in Crotalus durissus terrificus venom
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Thesis
Advisor
Yamanouye, Norma
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2012
Metrics
Rights
Open Access
URI

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