Estudo do possível efeito de alcalóides obtidos a partir da secreção cutânea de Rhinella jimi e R. icterica na penetração do vírus da raiva em células de mamífero mediado pelo receptor nicotínico de acetilcolina

A raiva é uma doença infecciosa aguda causada por um vírus que afeta o sistema nervoso central. O vírus se replica no local da inoculação e acredita-se que utilize os receptores nicotínicos da acetilcolina, localizados nas junções neuromusculares, para alcançar as terminações nervosas. Espécimes do gênero Bufo, recentemente dividido em Bufo no velho mundo e Rhinella no novo mundo, apresentam um grande número de alcalóides e esteróides m suas secreções cutâneas. O objetivo desse trabalho foi testar moléculas extraídas da secreção cutânea de anfíbios como possíveis interferentes no processo de infecção do vírus da raiva em células de mamífero. A secreção cutânea de Bufo (Rhinella sp.) foi coletada por estimulação mcânica. Foi realizada uma partição líquido- líquido (H2O-CH2Cl2) e as duas soluções resultantes foram purificadas por sistema RP-HPLC em coluna C18. A caracterização estrutural das moléculas foi realizada por espectrometria de massas. Foram realizados testes citotóxicos em células BHK-21 dos compostos isolados. Resumidamente, as células foram incubadas por 24h em placas de 96 orifícios com diferentes diluições das moléculas purificadas. Para os testes virológicos, foram realizados os testes de inibição de fluorescência e de inibição de focos fluorescentes, utilizando vírus fixo PV (Pasteur Virus), com tratamento simultâneo e com tempos diferentes de adição do vírus e das frações. Dezesseis frações foram obtidas por RP-HPLC. Os testes citotóxicos mostraram que 9 frações foram tóxicas para células BHK-21. Nos testes virológicos, a fração 2 mostrou um efeito duradouro, independente do tratamento simultâneo ou com tempos diferentes de adição do vírus e da fração. Análises por espectrometria de massas mostraram que essa fração contém um esteróide chamado helebrigenina. Além disso, essa fração não mostrou efeitos citotóxicos pelo teste MTT. A fração 14 foi capaz de reduzir a nfecção pelo vírus em ambos os testes, aparentemente apresentando efeitos de competição com o vírus por algum receptor. Análises por espectrometria de massas ostraram que essa fração contém dois alcalóides indólicos, N`,N`-imethyl 5- hydroxytryptamione (bufotenina) e N`,N`,N`-trimethyl 5-hydroxytryptamine (5-HTQ). Essa fração apresentou efeitos citotóxicos em células BHK-21 no teste MTT (66% células viáveis). As duas frações também foram efetivas em testes virológicos utilizando outra amostra de vírus da raiva, o CVS (Challenge Virus Standard). Os dois componentes da fração 14 foram isoladamente testados para atividade biológica e somente a bufotenina reteve efeitos antivirais. Análises por ressonância nuclear magnética confirmaram a estrutura da molécula. Foi realizado isolamento de bufotenina a partir de sementes de Anadenanthera colubrina, por extração em solução de acetona e purificação por RP-HPLC. A CC50 da bufotenina em células BHK-21 foi calculada após teste de MTT e análises pelo teste de Hoechst/PI indicaram que o efeito citotóxico da molécula está possivelmente relacionado a apoptose. O IC50 da bufotenina no vírus PV foi calculado após realização do teste de inibição de focos fluorescentes com diferentes concentrações dose-resposta de bufotenina. A bufotenina também apresentou atividade antiviral com diferentes amostras virais isoladas de animais infectados em células N2A.
Keywords
Anura;  antiviral;  animal toxins;  rabies;  alkaloids;  toxinas animais;  raiva;  alcalóides

Other Titles
Evaluation of the effects of alkaloids isolated from the skin secretion of Rhinella Jimi and R. icterica in the penetration of rabies virus in mammalian cells mediated by nicotinic acetylcholine receptors
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Thesis
Advisor
Pimenta, Daniel Carvalho
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2013
Metrics
Rights
Open Access
URI

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