Estudo do possível efeito de alcalóides obtidos a partir da secreção cutânea de Rhinella jimi e R. icterica na penetração do vírus da raiva em células de mamífero mediado pelo receptor nicotínico de acetilcolina

Translated title
Evaluation of the effects of alkaloids isolated from the skin secretion of Rhinella Jimi and R. icterica in the penetration of rabies virus in mammalian cells mediated by nicotinic acetylcholine receptors

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
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Abstract
Rabies is an acute infectious disease caused by a virus that affects the central nervous system. The virus replicates at the inoculation site and it is believed that it uses the nicotinic acetylcholine receptors, located in the neuromuscular junctions to reach the nerve endings. The genus Bufo, recently split into Bufo in the Old World and Rhinella in the New World, contain a large number of alkaloids and steroids in their skin secretion. The aim of this study was to assay molecules extracted from the skin of amphibians as possible interfering agents in the process of infection of the rabies virus in mammalian cells. Bufo (Rhinella sp.) skin secretions were collected through mechanical stimulation. A liquid-liquid partition (H2O-CH2Cl2) was performed and the two resulting solutions were purified by RP-HPLC, in a C18 column. Structural characterization was performed by mass spectrometry. Cytotoxic tests of the isolated compounds were performed over BHK-21 cells. Briefly, 96-well microtiter plates containing the cells were incubated for 24h in the media containing different dilutions of the purified molecules. For the virologic test, fixed strain PV (Pasteur Virus) was used on fluorescence inhibition test and fluorescent foci inhibition test, with both simultaneous and time course treatment of the cells with the virus and the fractions. Sixteen fractions were obtained by RP- PLC. The cytotoxic tests revealed that 9 fractions were toxic to BHK-21cells. On the virologic test, fraction 2 showed a lasting effect, independent from the simultaneous and time course treatments in both tests. Mass spectrometric analyses showed that this fraction contains a steroid named hellebrigenin. This fraction also showed no cytotoxic effect on MTT test. Fraction 14 was able to reduce rabies virus infection in both tests, apparently showing competition effects. Mass spectrometric analyses showed that this fraction contains two indole alkaloids, N`,N`-dimethyl 5-hydroxytryptamione (bufotenine) and N`,N`,N`-trimethyl 5-hydroxytryptamine (5-HTQ). This fraction showed cytotoxic effect on MTT test (66% viable cells). The two fractions also showed effects against CVS (Chalenge Virus Standard), another sample of rabies virus. The two individual components of fraction 14 were tested for biological activity in order to evaluate which retains the biological effect and only bufotenine showed antiviral effects. NMR analyses confirmed the structure of this molecule. Bufotenine was extracted from seeds of Anadenanthera colubrina in acetone solution and purified by RP-HPLC. The CC50 on BHK-21 cells was calculated after MTT test, and Hoechst/PI test indicated that the cytotoxic effect of bufotenine is possibly related with apoptosis. The IC50 of PV virus was calculated after foci inhibition test with dose-response bufotenine concentrations. When tested in N2A cell line, bufotenine was also effective against different samples of rabies virus isolated from infected animals.
metadata.dc.description.abstractpt
A raiva é uma doença infecciosa aguda causada por um vírus que afeta o sistema nervoso central. O vírus se replica no local da inoculação e acredita-se que utilize os receptores nicotínicos da acetilcolina, localizados nas junções neuromusculares, para alcançar as terminações nervosas. Espécimes do gênero Bufo, recentemente dividido em Bufo no velho mundo e Rhinella no novo mundo, apresentam um grande número de alcalóides e esteróides m suas secreções cutâneas. O objetivo desse trabalho foi testar moléculas extraídas da secreção cutânea de anfíbios como possíveis interferentes no processo de infecção do vírus da raiva em células de mamífero. A secreção cutânea de Bufo (Rhinella sp.) foi coletada por estimulação mcânica. Foi realizada uma partição líquido- líquido (H2O-CH2Cl2) e as duas soluções resultantes foram purificadas por sistema RP-HPLC em coluna C18. A caracterização estrutural das moléculas foi realizada por espectrometria de massas. Foram realizados testes citotóxicos em células BHK-21 dos compostos isolados. Resumidamente, as células foram incubadas por 24h em placas de 96 orifícios com diferentes diluições das moléculas purificadas. Para os testes virológicos, foram realizados os testes de inibição de fluorescência e de inibição de focos fluorescentes, utilizando vírus fixo PV (Pasteur Virus), com tratamento simultâneo e com tempos diferentes de adição do vírus e das frações. Dezesseis frações foram obtidas por RP-HPLC. Os testes citotóxicos mostraram que 9 frações foram tóxicas para células BHK-21. Nos testes virológicos, a fração 2 mostrou um efeito duradouro, independente do tratamento simultâneo ou com tempos diferentes de adição do vírus e da fração. Análises por espectrometria de massas mostraram que essa fração contém um esteróide chamado helebrigenina. Além disso, essa fração não mostrou efeitos citotóxicos pelo teste MTT. A fração 14 foi capaz de reduzir a nfecção pelo vírus em ambos os testes, aparentemente apresentando efeitos de competição com o vírus por algum receptor. Análises por espectrometria de massas ostraram que essa fração contém dois alcalóides indólicos, N`,N`-imethyl 5- hydroxytryptamione (bufotenina) e N`,N`,N`-trimethyl 5-hydroxytryptamine (5-HTQ). Essa fração apresentou efeitos citotóxicos em células BHK-21 no teste MTT (66% células viáveis). As duas frações também foram efetivas em testes virológicos utilizando outra amostra de vírus da raiva, o CVS (Challenge Virus Standard). Os dois componentes da fração 14 foram isoladamente testados para atividade biológica e somente a bufotenina reteve efeitos antivirais. Análises por ressonância nuclear magnética confirmaram a estrutura da molécula. Foi realizado isolamento de bufotenina a partir de sementes de Anadenanthera colubrina, por extração em solução de acetona e purificação por RP-HPLC. A CC50 da bufotenina em células BHK-21 foi calculada após teste de MTT e análises pelo teste de Hoechst/PI indicaram que o efeito citotóxico da molécula está possivelmente relacionado a apoptose. O IC50 da bufotenina no vírus PV foi calculado após realização do teste de inibição de focos fluorescentes com diferentes concentrações dose-resposta de bufotenina. A bufotenina também apresentou atividade antiviral com diferentes amostras virais isoladas de animais infectados em células N2A.
Reference
VIGERELLI, Hugo. Estudo do possível efeito de alcalóides obtidos a partir da secreção cutânea de Rhinella jimi e R. icterica na penetração do vírus da raiva em células de mamífero mediado pelo receptor nicotínico de acetilcolina. 2013. 93 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2013.
Vigerelli H. Estudo do possível efeito de alcalóides obtidos a partir da secreção cutânea de Rhinella jimi e R. icterica na penetração do vírus da raiva em células de mamífero mediado pelo receptor nicotínico de acetilcolina [Evaluation of the effects of alkaloids isolated from the skin secretion of Rhinella Jimi and R. icterica in the penetration of rabies virus in mammalian cells mediated by nicotinic acetylcholine receptors] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2013. 93 p. Portuguese
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3322
Issue Date
2013


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