Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca

Translated title
Analysis of the individual variation of the venom proteome of Bothrops jararaca newborn specimens

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
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Abstract
Envenomation by Bothrops snakes cause local damage as well as systemic, hemostatic and cardiovascular effects. Ontogenetic changes and variations related to animal gender, composition and activities of individual adult venoms are features commonly reported in the literature, however, the variation in the composition of newborn snake venom is still unknown. For this study, venom from 21 newborn specimens of B. jararaca was milked and stored at -20°C until use. Protein quantification in the fresh venoms varied among individuals however most of them showed values between 110 and 120 mg/ml. Venom electrophoretic profiles were analyzed under reducing and non-reducing conditions and showed various differential protein bands among the venoms. Glycoprotein staining showed some subtle variations in the individual venom glycoproteomes. Comparison of the venoms by Western blot analysis using an anti-metalloproteinase antibody (anti-bothropasin) showed intense recognition of various protein bands, however their molecular masses varied among the venoms. Likewise, recognition of serine proteinases in the venoms by an anti-serine proteinase antibody (anti MSP1/MSP2) revealed bands of variable molecular masses in newborn venoms. Considering the importance of the proteolytic activity in B. Jararaca accidents, two different substrates were used for measuring this activity: i) casein, a protein that can be degraded by both metalloproteinases and serine proteinases; ii) benzoyl-L arginyl-pNA (L-BAPNA), a synthetic substrate which is only degraded by trypsin-like serine proteinases. The caseinolytic activity did not vary among the venoms, however, individual values of amidolytic activity upon L BAPNA were significantly different among the venoms and some of them did not hydrolyze this substrate. Similarly, the coagulant activity was assessed by the determination of the Minimum Coagulant Dose and showed remarkable variability among the venoms. Analysis of the venoms by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) showed significant differences between some samples, however, an interesting finding was the ubiquitous presence in these venoms of the tripeptide <E-K-W, which is an important inhibitor of venom metalloproteinases. The electrophoretic profiles of proteins submitted to reduction of disulfide bonds showed significant variability among the venoms and identification of proteins by in gel trypsin digestion followed by LC-MS/MS was carried out to identify proteins differentially expressed in the individual newborn venoms. On the other hand, the electrophoretic profiles of venoms analyzed under non-reducing conditions showed less individual variability and the identification of proteins present in a region of the gel which contained a broad protein band present in all venoms revealed the presence of metalloproteinases, L-amino acid oxidase, and amino peptidase as common components of these venoms.
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Venenos do gênero Bothrops causam, além de efeitos locais, efeitos sistêmicos sobre os sistemas hemostático e cardiovascular. Mudanças ontogenéticas, além de variações relacionadas ao sexo do animal, na composição individual e atividades dos venenos de adultos, são características frequentemente reportadas na literatura, entretanto, a variação na composição individual de venenos de filhotes de serpentes deste gênero não é conhecida. Para este estudo, o veneno de 21 filhotes de B. jararaca foi extraído e estocado individualmente a -20°C até o uso. A quantificação de proteínas nos venenos variou entre os indivíduos, porém a maioria apresentou valores de 110-120 mg/ml. Os perfis eletroforéticos foram analisados com e sem redução das pontes de dissulfeto das proteínas e diversas diferenças foram visualizadas entre os venenos. O perfil eletroforético dos venenos com coloração para glicoproteínas mostrou sutis diferenças. A análise por Western blot utilizando m anticorpo anti-bothropasina mostrou reconhecimento significativo, porém variável, de bandas contendo metaloproteinases, na maioria dos venenos. Da mesma forma, a análise utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2, revelou variação com relação às massas moleculares e intensidades das bandas reconhecidas contendo serinoproteinases. Considerando a importância da atividade proteolítica nos envenenamentos, foram utilizados dois substratos diferentes para a determinação dessa atividade: a proteína caseína, que pode ser degradada tanto por serinoproteinases como metaloproteinases e o substrato sintético Lbenzoil-Arginil- NA L-BAPNA) que é degradado somente por serinoproteinases. Valores de atividade caseinolítica específica não apresentaram variação expressiva entre os venenos, porém quanto à atividade amidolítica sobre o substrato L-BAPNA os venenos mostraram significantemente diferentes, e alguns deles não apresentaram atividade enzimática sobre este substrato. Da mesma forma, a atividade coagulante sobre o plasma humano, determinada pela Dose Mínima Coagulante, mostrouse bastante variável entre os indivíduos. A análise dos venenos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) apresentou diferenças significativas entre algumas amostras, contudo uma característica ubíqua foi a presença do tripeptídeo <EKW em todos os venenos, um importante tripeptídeo, que é inibidor de metaloproteinases. O perfil eletroforético dos venenos, analisados com as proteínas submetidas à redução de pontes de dissulfeto, mostrou significativa variabilidade e a identificação de proteínas por digestão in gel com tripsina seguida de análise por LC-MS/MS foi realizada com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas nos venenos individuais de filhotes. Por outro lado, a análise eletroforética comparativa dos venenos em condições nãoredutoras mostrou perfis individuais menos variáveis, quando comparados com a análise com redução, e a identificação de proteínas presentes em uma região do gel, que era semelhante entre os venenos, levou à identificação de metaloproteinases, L-aminoácido- xidase, e aminopeptidase, que seriam toxinas comuns entre eles. Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram a expressiva variabilidade individual nos venenos de filhotes de B. jararaca, fato que já havia sido demonstrado em venenos individuais de adultos desta espécie, e sugerem que a variação individual nos venenos está presente desde o nascimento, não sendo um reflexo da ontogenia do animal. Estes achados servem como subsídios para o entendimento das bases moleculares da variabilidade de venenos de serpentes, sobretudo da B. jararaca.
Reference
DIAS, Gabriela da Silva. Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca. 2013. 143 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2013.
Dias GS. Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de Bothrops jararaca [Analysis of the individual variation of the venom proteome of Bothrops jararaca newborn specimens] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2013. 143 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3325
Issue Date
2013


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