Efeito da Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina do veneno de Bothrops jararaca, sobre um modelo experimental in vitro de cicatrização

Integrinas específicas ancoram as células endoteliais aos componentes da matriz extracelular, modulando eventos durante os processos de angiogênese e cicatrização. Jararagina-C (JAR-C) é uma molécula tipo-disintegrina, que contém uma sequência ECD, isolado a partir do veneno de Bothrops jararaca, e age na inibição da agregação plaquetária. As células endoteliais, por sua vez expressam diferentes integrinas na sua superfície de acordo com o ambiente. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do JAR-C nas células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) durante os eventos iniciais do processo de cicatrização. Primeiramente, verificamos a capacidade de ligação da JAR-C em HUVECs através de ensaio de inibição da adesão celular. Não observamos nenhuma diminuição estatisticamente significativa na adesão das células ao colágeno I, sugerindo que a JAR-C se liga às HUVECs. Realizamos o ensaio de migração celular em monocamada de HUVECs no modelo experimental de cicatrização de feridas, onde as células foram cultivadas no substrato de colágeno I e IV. Após 24 horas de tratamento com JAR-C, as células foram coradas e analisadas por microscopia óptica. Observamos que esta molécula induziu a migração celular em ambos os substratos, entretanto a confluência de 100% das células no interior da linha raspada ocorreu apenas sobre o substrato de colágeno I. Avaliamos a atividade proliferativa nas células endoteliais cultivadas nos substratos de colágeno I, IV ou fibronectina e tratadas com JAR-C. O ensaio de proliferação foi realizado pelo método de BrdU. Observamos que a JAR-C não interferiu na capacidade proliferativa destas células. Verificamos então a curva tempo-resposta de 9 genes envolvidos no processo de cicatrização. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real em HUVEC cultivadas em colágeno e tratada com JAR-C, e comparado a um grupo controle tratado com PBS. O fold change (Fc) foi calculado pela equação de ΔΔct. No intervalo de tempo de 3 horas observamos uma regulação positiva de IL-6, CXCL-6 e MMP-10 (Fc = 3,0; 1,8 e 2,3, respectivamente) e regulação negativa de IL-8 (Fc = - 15 0,7). Após 6 horas os genes de E-selectina, I-CAM-1, V-CAM-1, IL-8, Angiopoetina-2 e MMP-10 também foram regulados positivamente (Fc = 6,0; 7,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 2,0, respectivamente), enquanto IL-6 foi regulado negativamente (Fc = -0,5). Em 24 horas observamos a regulação negativa de IL-8, CXCL-6 e CD-69 (Fc = -0,5, -0,3 e - 0,4, respectivamente). Os nossos resultados sugerem que a JAR-C pode ligar-se a células endoteliais que crescem sobre a superfície de colágeno I. A JAR-C modula a migração HUVEC sobre os substratos de colágeno I e IV. No entanto, esta molécula não induz a proliferação de células endoteliais sobre estes substratos. A JAR-C induz uma regulação positiva de genes expressos por células endoteliais envolvidos com o processo de cicatrização. A capacidade da JAR-C em ligar-se a integrina α2β1, bem como ao colágeno, é, provavelmente, responsável pelos efeitos aqui observados.
Keywords
Jararagina-C;  células endoteliais;  atividade biológica;  expressão gênica;  plaqueta;  Jararhagin-C;  endothelial cells;  biological activity;  gene expression;  platelets

Other Titles
Effects of Jararhagin-C, a disintegrin-like molecule from Bothrops jararaca venom, on wound healing experimental model
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Master's thesis
Advisor
Clissa, Patricia Bianca
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTox)
Submission Date
2013
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