Efeito da Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina do veneno de Bothrops jararaca, sobre um modelo experimental in vitro de cicatrização

Translated title
Effects of Jararhagin-C, a disintegrin-like molecule from Bothrops jararaca venom, on wound healing experimental model

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
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Open Access
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Abstract
There are a number of specific integrins that anchor endothelial cells to extracellular matrix components, modulating events during angiogenesis and wound healing process. Jararhagin-C is a disintegrin-like molecule containing an ECD sequence isolated from Bothrops jararaca venom which can inhibit platelet aggregation. Endothelial cells in turn express different integrins on its surface according to the environment. This study aimed to investigate the effects of jararhagin-C on human vascular endothelial cells (HUVEC) during initial events related to wound healing process. Firstly it was verified the binding capacity of jararhagin-C on HUVECs through inhibition of cell adhesion assay. Suspensions of HUVECs were incubated with jararhagin-C and seeded on well plates pre-coated with collagen I, IV or fibronectin on its surface. It was not observed a statistic significance decrease in adhesion cells to matrix extracellular. The cell migration assay was performed on HUVECs monolayer in model of wound healing experiment. The cells were grown on collagen I and IV surfaces. After 24 hours of jararhagin-C treatment, cells were stained and analyzed by optical microscope. This molecule induced cell migration on both substrates however the 100% confluence of cells inside the scraped line was observed only with collagen I. The proliferative activity was evaluated by endothelial cells cultivated on collagen I, IV or fibronectin substrate and jararhagin-C treated. The proliferation assay was performed by BrdU method. Jararhagin-C does not interfere in the proliferative capacity of these cells. Finally we analyzed the timecourse of 9 genes involved in the wound healing process. The gene expression was evaluated by Real-time PCR on HUVECs previously adhered to collagen treated by jararhagin-C and compared with a control group of cells treated with PBS. The fold change (Fc) was calculated by ΔΔct equation. At the time interval of 3 hours we observed up-regulation of IL-6, CXCL-6, and MMP-10 (Fc = 3.0; 1.8 and 2.5 respectively) and IL-8 was down-regulated (Fc = -0,7). At 6 hours the genes ESelectin, I-CAM-1, V-CAM, IL-8, Angiopoetin-2 and MMP-10 were up-regulated (FC = 6.0; 7.0; 1,5; 2.0; 2.5 and 2.0 respectively) while IL-6 was down regulated (Fc = -0.5). At 24 hours we observed down regulation of IL-8, CXCL-6 and CD-69 (Fc= -0.5; -0.3 and -0.4 respectively). Our results suggest that jararhagin-C can bind to endothelial cells growing on collagen I surface. Jararhagin-C can modulate HUVEC migration on collagen I and IV surfaces. However this molecule by itself is not able to induce endothelial cells proliferation on these substrates. Jararhagin-C induces upregulation of genes expressed by endothelial cells involved with wound healing process. The jararhagin-C ability to bind to integrin α2β1, as well as collagen, is probably the responsible by the effects observed here.
metadata.dc.description.abstractpt
Integrinas específicas ancoram as células endoteliais aos componentes da matriz extracelular, modulando eventos durante os processos de angiogênese e cicatrização. Jararagina-C (JAR-C) é uma molécula tipo-disintegrina, que contém uma sequência ECD, isolado a partir do veneno de Bothrops jararaca, e age na inibição da agregação plaquetária. As células endoteliais, por sua vez expressam diferentes integrinas na sua superfície de acordo com o ambiente. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do JAR-C nas células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) durante os eventos iniciais do processo de cicatrização. Primeiramente, verificamos a capacidade de ligação da JAR-C em HUVECs através de ensaio de inibição da adesão celular. Não observamos nenhuma diminuição estatisticamente significativa na adesão das células ao colágeno I, sugerindo que a JAR-C se liga às HUVECs. Realizamos o ensaio de migração celular em monocamada de HUVECs no modelo experimental de cicatrização de feridas, onde as células foram cultivadas no substrato de colágeno I e IV. Após 24 horas de tratamento com JAR-C, as células foram coradas e analisadas por microscopia óptica. Observamos que esta molécula induziu a migração celular em ambos os substratos, entretanto a confluência de 100% das células no interior da linha raspada ocorreu apenas sobre o substrato de colágeno I. Avaliamos a atividade proliferativa nas células endoteliais cultivadas nos substratos de colágeno I, IV ou fibronectina e tratadas com JAR-C. O ensaio de proliferação foi realizado pelo método de BrdU. Observamos que a JAR-C não interferiu na capacidade proliferativa destas células. Verificamos então a curva tempo-resposta de 9 genes envolvidos no processo de cicatrização. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real em HUVEC cultivadas em colágeno e tratada com JAR-C, e comparado a um grupo controle tratado com PBS. O fold change (Fc) foi calculado pela equação de ΔΔct. No intervalo de tempo de 3 horas observamos uma regulação positiva de IL-6, CXCL-6 e MMP-10 (Fc = 3,0; 1,8 e 2,3, respectivamente) e regulação negativa de IL-8 (Fc = - 15 0,7). Após 6 horas os genes de E-selectina, I-CAM-1, V-CAM-1, IL-8, Angiopoetina-2 e MMP-10 também foram regulados positivamente (Fc = 6,0; 7,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 2,0, respectivamente), enquanto IL-6 foi regulado negativamente (Fc = -0,5). Em 24 horas observamos a regulação negativa de IL-8, CXCL-6 e CD-69 (Fc = -0,5, -0,3 e - 0,4, respectivamente). Os nossos resultados sugerem que a JAR-C pode ligar-se a células endoteliais que crescem sobre a superfície de colágeno I. A JAR-C modula a migração HUVEC sobre os substratos de colágeno I e IV. No entanto, esta molécula não induz a proliferação de células endoteliais sobre estes substratos. A JAR-C induz uma regulação positiva de genes expressos por células endoteliais envolvidos com o processo de cicatrização. A capacidade da JAR-C em ligar-se a integrina α2β1, bem como ao colágeno, é, provavelmente, responsável pelos efeitos aqui observados.
Reference
LIMA, Iara Camargo. Efeito da Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina do veneno de Bothrops jararaca, sobre um modelo experimental in vitro de cicatrização. 2013. 82 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2013.
Lima IC. Efeito da Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina do veneno de Bothrops jararaca, sobre um modelo experimental in vitro de cicatrização [Effects of Jararhagin-C, a disintegrin-like molecule from Bothrops jararaca venom, on wound healing experimental model] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2013. 82 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3326
Issue Date
2013


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