Obtenção e atividade biológica de uma nova disintegrina recombinante do veneno de Bothrops neuwiedi, Dis-BnMPIIx

As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas altamente versáteis, responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, ativação ou hidrólise de componentes da cascata de coagulação e fibrinólise, inibição da agregação plaquetária, indução de hemorragia local e sistêmica, atividade pró-inflamatória, entre outras. Essa ampla gama de atividades biológicas está relacionada com a diversidade estrutural dessa família de proteínas. As SVMPs são divididas em classes e subclasses de PI a PIII de acordo com a organização dos seus domínios. As SVMPs de classe PI são compostas apenas pelo domínio catalítico, já as PIII possuem domínio catalítico, tipo disintegrina e rico em cisteína. As SVMPs PII, possuí domínio catalítico e disintegrina ou apenas de disintegrina livre que geralmente apresenta o tripeptídeo RGD. Para melhor entender a diversidade estrutural e funcional das SVMPs, foram sequenciados cDNAs da glândula de veneno Bothrops neuwiedi que codificam SVMPs. Foram encontradas novas SVMPs, distintas das descritas em venenos de outras espécies. A BnMPIIx, uma SVMP de classe PII,apresentou uma sequência bastante peculiar com a fusão de um domínio catalítico similar ao de SVMPs pró-coagulantes da classe P-III com um domínio RGD-disintegrina, de SVMPs classe P-II, contendo cisteínas em posições não descritas anteriormente. O objetivo deste trabalho foi obter a BnMPIIx e seu domínio disintegrina na forma recombinante através de vetores de E. coli que direcionam para o periplasma (pET20) ou vetores que proporcionam a fusão com chaperonas (pET32 e pSMT3). Para isto, o cDNA da BnMPIIx e de seu dominínio disintegrina foram amplificados por PCR, digeridos com as endonucleases BamHI e HindIII e clonados em vetor pET20. O domínio disintegrina também foi clonado nos vetores pET32 e pSMT3 que expressam as proteínas com as chaperonas Tioredoxina (Trx) e SUMO, respectivamente. O sequenciamento de todos os insertos não apresentou mutações. Estes vetores foram transformados nas linhagens de E. coli BL21 (DE3) ou C43 (DE3) e a expressão avaliada em duas temperaturas (30ºC e 37ºC). Para o ensaio de inibição da agregação plaquetária, foi coletado sangue humano de doadores voluntários saudáveis em 3,8% de citrato de sódio (1:9). O sangue foi centrifugado e o plasma rico em plaquetas (PRP) submetido à agregação plaquetária induzida por ADP. A análise por SDS-PAGE mostrou que tanto a BnMPIIx quanto seu domínio disintegrina foram obtidos parcialmente solúveis em ambas as temperaturas (30ºC e 37ºC), gerando corpos de inclusão em vetor pET20. Já a disintegrina foi obtida com sucesso nos vetores pET32 e pSMT3 e foram denominadas Dis-Trx e Dis-SUMO respectivamente, no entanto não apresentaram atividade biológica. Após a clivagem da Trx, não foi possível isolar a disintegrina para validar a atividade biológica da Dis-Trx, já após a clivagem da SUMO a disintegrina inibiu completamente a agregação plaquetária em concentrações da ordem de 2 µM. Após diversas tentativas de clonagem usando diferentes vetores, nós obtivemos uma nova disintegrina recombinante de Bothrops neuwiedi em vetor pSMT3 com atividade biológica preservada, podendo esta molécula contribuir para os estudos de hemostasia e câncer.
Keywords
Dis-BnMPIIx;  Disintegrina;  Bothrops neuwiedi;  Expressão gênica;  Agregação plaquetária;  Dis-BnMPIIx;  Disintegrin;  Bothrops neuwiedi;  Gene Expression;  Platelet Aggregation

Other Titles
Obtention and biological activity of a new recombinant disintegrin from Bothrops neuwiedi venom, Dis-BnMPIIx
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Thesis
Advisor
Moura-da-Silva, Ana Maria
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2013
Metrics
Rights
Open Access
URI

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