Efeito do BjKgn (Bothrops jararaca Kininogen) sobre proteases processadoras de citocinas pró-inflamatórias e sobre atividades biológicas de macrófagos

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Effect of BjKgn (Bothrops jararaca Kininogen). on processing proteases of pro-inflammatory cytokines and on biological activities of macrophage

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Master's thesis
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The plasma of B.jararaca snake is rich in protease inhibitors. A potent inhibitor of cysteine-protease was isolated from its plasma and named BjKgn. This protein has similar characteristics to the human high molecular weight kininogen (HK), since it has a molecular mass of 110 kDa, releases a pharmacologically active peptide and besides that, It is an inhibitor of cysteine-protease. Both BjKgn and HK exhibit inhibitory activity on Jararhagin (JAR), hemorrhagic metalloprotease isolated from the venom of the same species snakes. JAR is an enzyme capable of inducing the release of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), cytokine-related to dermonecrosis activity of Bothops snake venom. This cytokine is expressed on the cell surface and cleaved by a metalloprotease, called TACE (TNF-α converting enzyme) resulting in the release of soluble TNF-α. Another important cytokine that participates during the poisoning by Bothrops snakes is the Interleukin-1β (IL-1β). It is intracellularly processed by ICE (Interleukin converting enzyme), a cysteine-proteinase which belongs to the family of caspases. The objectives of this study were to evaluate the possible inhibitory effect of BjKgn on ICE, TACE, and the effect on some functions of peritoneal adherent cells, such as spreading, phagocytosis, production of hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide ( NO) and TNF-α and IL-1β. The tests with TACE and ICE were performed using fluorescent substrates corresponding to their respective enzymes and different concentrations of BjKgn. Spreading and phagocytosis tests were conducted using adherent peritoneal cells stimulated or not, and different concentrations of BjKgn (0.5 µg, 1μg, 1.5 µg, 2 µg and 3μg). Tests for production of H2O2, NO and cytokine release were performed only with stimulated cells and 3 µg of BjKgn. Cells were adhered and incubated in the presence or absence of BjKgn for 1 hour in all ex vivo experiments but the ones for the cytokine release, which the cells were remained on contact with the protein for 12 hours. The results showed that BjKgn, on the used doses, was able to competitively inhibit TACE and ICE enzymes with the inhibition constants of 2 mM and 370 mM, respectively. Regarding the activities of peritoneal exudate cells, the protein did not affect any of the activities at doses of BjKgn used, since the cells presented the ability of spreading, phagocytosis, production of H2O2 and NO similar to those displayed by cells of the control group. Despite ICE and TACE inhibition in vitro, BjKgn did not influence on the release of TNF-α and IL-1β. We have concluded that BjKgn protein is an inhibitor of cysteineproteases and metalloproteases since it inhibited TACE and ICE in vitro and that, at least at the doses used, the protein does not affect the metabolic or biological adherent peritoneal cells function and it was not able to inhibit release of TNF- α and IL-1β by these cells.
O plasma da serpente B. jararaca é rico em inibidores de proteases. Dele foi isolado um potente inibidor de cisteíno-protease, o BjKgn. Este possui características similares ao cininogênio de alto peso molecular humano (HK), já que possui uma massa molecular de 110kDa, libera um peptídeo farmacologicamente ativo e além de ser um inibidor de cisteíno-protease. Tanto o BjKgn quanto o HK apresentam atividade inibitória sobre a jararagina (JAR), uma metaloprotease hemorrágica do veneno de serpentes da mesma espécie. A JAR é uma enzima capaz de induzir a liberação de fator de necrose tumoral-alpha (TNF-), citocina relacionada com a atividade dermonecrosante do veneno. Essa citocina é expressa na superfície celular e clivada por uma metaloprotease, a TACE (TNF-converting enzyme), resultando na liberação do TNF- solúvel. Outra citocina importante durante o processo de envenenamento por serpentes Bothrops é a interleucina-1β (IL-1β), que é processada intracelularmente pela ICE (Interleukin converting enzyme), uma cisteíno-protease pertencente à família das caspases. Assim, os objetivos do presente trabalho foram testar o possível efeito inibitório do BjKgn sobre a ICE, TACE, bem como o efeito sobre as funções de células peritoneais aderentes, como espraiamento, fagocitose, produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), Óxido Nítrico (NO) e TNF- e IL-1. Para os testes com TACE e ICE, utilizamos substratos fluorescentes respectivos às enzimas e diferentes concentrações de BjKgn. Os testes de espraiamento e fagocitose foram realizados utilizando células peritoneais aderentes estimuladas ou não, e diferentes concentrações de BjKgn (0,5 µg,1µg, 1,5 µg, 2 µg e 3µg). Os testes de produção de H2O2, NO e dosagem de citocinas foram realizados utilizando apenas células estimuladas e 3 µg de BjKgn. As células foram aderidas e incubadas na presença ou não da proteína BjKgn por 1 hora em todos os experimentos em ex vivo, com exceção da dosagem de citocinas, que permaneceu em contato com a proteína por 12 horas. Os resultados demonstraram que o BjKgn, nas doses utilizadas, foi capaz de inibir as enzimas TACE e ICE competitivamente, com constantes de inibição de 2 mM e 370 μM, respectivamente. Em relação às atividades das células do exsudato peritoneal, a proteína não influenciou nenhuma das atividades nas doses de BjKgn utilizadas, uma vez que apresentaram capacidade de espraiamento, fagocitose, produção de H2O2 e NO semelhantes às apresentadas pelas células dos grupos controle. Apesar de inibir as enzimas ICE e TACE, in vitro, o Bjkgn não influenciou na liberação de TNF-α e IL-1β. Podemos concluir que a proteína BjKgn é uma inibidora de cisteíno-proteases e metaloproteases já que inibiu in vitro a TACE e a ICE e que, ao menos nas doses utilizadas, não afeta as funções metabólicas ou biológicas de células peritoneais aderentes e não foi capaz de inibir a liberação do TNF- e IL-1 por estas células.
KODAMA, Karina Kiyoko. Efeito do BjKgn (Bothrops jararaca Kininogen) sobre proteases processadoras de citocinas pró-inflamatórias e sobre atividades biológicas de macrófagos. 2013. 71 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2013.
Kodama KK. Efeito do BjKgn (Bothrops jararaca Kininogen) sobre proteases processadoras de citocinas pró-inflamatórias e sobre atividades biológicas de macrófagos[Effect of BjKgn (Bothrops jararaca Kininogen). on processing proteases of pro-inflammatory cytokines and on biological activities of macrophage] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2013. 71 p. Portuguese
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