Análise do conteúdo da secreção cutânea do anuro Pipa carvalhoi a procura de possíveis moléculas com atividades biológicas relevantes

A busca por novas moléculas com atividades biológicas e/ou aplicações biotecnológicas cresce atualmente, principalmente moléculas ativas contra microrganismos. Em função disto, os peptídeos vêm sendo estudados, principalmente pelo fato de que a ação antimicrobiana se deve a interações físicoquímicas com a membrana bacteriana, levando a uma menor chance de a bactéria desenvolver resistência. Sendo assim, vários animais vêm sendo estudados, dentre eles os anfíbios, os quais são capazes de sintetizar e secretar diferentes classes de moléculas, como alcaloides, esteroides, peptídeos e proteínas. Após a descoberta das Magaininas, peptídeos antimicrobianos presentes na secreção cutânea de Xenopus laevis, cresceram a procura por outros peptídeos antimicrobianos nos anfíbios. Devido à relação evolucionária com o X. laevis, nós analisamos bioquimicamente a secreção cutânea do anuro Pipa carvalhoi, inicialmente procurando identificar a presença de peptídeos antimicrobianos. A secreção cutânea de P. carvalhoi foi obtida através da estimulação química (administrando cloridrato de noradrenalina 1 ou 50 nmol/g), mecânica ou na ausência de estímulo. Obteve-se também a secreção de anuros recém-coletados e trazidos para o biotério. As secreções foram liofilizadas, ressuspendidas e filtradas em membranas de corte molecular (10 kDa). Somente utilizou-se neste estudo a fração menor que 10 kDa. Este material foi analisado através da cromatografia líquida (RP – HPLC) e da espectrometria de massas. Após as análises cromatográficas, as secreções coletadas apresentaram perfis cromatográficos semelhantes, independente de estímulo químico ou mecânico ou se o animal era recém-coletado ou se já estava aclimatado no biotério. A comparação dos cromatogramas sugere que P. carvalhoi é capaz de secretar, na sua pele, níveis basais dos principais componentes. Nas análises por espectrometria de massas, os materiais obtidos tanto pela estimulação mecânica quanto química mostraram possuir as mesmas moléculas majoritárias (mesmas relações m/z), evidenciando que na secreção existe um grupo de moléculas que não varia em função da coleta. Além disto, corrobora a eficácia da utilização da estimulação mecânica para a obtenção do material, preferencialmente à estimulação química. A secreção cutânea foi fracionada em 14 frações por RP– HPLC, sendo estas analisadas por espectrometria de massas (ESI – IT – TOF) e testadas em ensaios antimicrobianos. As análises não identificaram a presença de peptídeos, sendo encontradas somente moléculas de baixa massa molecular (< 800 Da). Entre os vários testes biológicos realizados, a fração 11 foi capaz de reduzir o crescimento microbiano de bactérias gram-positivas (aproximadamente 95 %). Quando reanalisada por RP – HPLC, a fração 11 foi subdividida em 9 frações (11.1 - 11.9). As frações 11.7 - 11.8 foram efetivas novamente em bactérias gram-positivas. Nas análises por espectrometria de massas, foi observado que as frações 11.6 – 11.8 contêm as mesmas relações m/z (m/z 577 Da), sugerindo que se trata de isômeros. Esta molécula possivelmente protege o animal contra as infecções bacterianas, como a exemplo das magaininas ou outros peptídeos antimicrobianos em X. laevis. O pico majoritário da secreção de P. carvalhoi (m/z 188) foi purificado e submetido à caracterização estrutural (NMR), sendo identificado como ácido quinurênico. No entanto, neste estudo, ainda não foi possível associar um efeito biológico ao ácido quinurênico.
Keywords
Venenos;  Atividades Biológicas;  Pipidae;  Xenopu;  Poisons;  Biological Activities;  Anura

Other Titles
Analysis of the skin secretion of the anura Pipa carvalhoi searching for new molecules with relevant biological
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Thesis
Advisor
Pimenta, Daniel Carvalho
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2014
Metrics
Rights
Open Access
URI

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