Análise do conteúdo da secreção cutânea do anuro Pipa carvalhoi a procura de possíveis moléculas com atividades biológicas relevantes

Translated title
Analysis of the skin secretion of the anura Pipa carvalhoi searching for new molecules with relevant biological

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
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Abstract
The search of new molecules presenting relevant biological activities or biotechnology applications is constantly increasing, mostly against microorganism. Different peptides are being studied, since antimicrobials effects occurs by physicalchemical membrane interactions, it would be difficult to bacteria develop resistance. Thus, innumerous animals have been studied, including amphibians that could produce and secrete promising molecules, such as alkaloids, peptides, proteins and steroids. Since the discovery of Magainins, antimicrobial peptides present in the skin secretion of the frog Xenopus laevis, the search for new molecules with antimicrobial activity was intensified in others amphibians. Due to the evolutionary relationship with X. leavis, we studied biochemically the skin secretion of the frog Pipa carvalhoi, aiming to identify antimicrobial peptides. Skins secretion solutions from P. carvalhoi were obtained after chemical (administration of 1 or 50 nmol/g norepinephrine hydrochloride) or mechanical stimuli, or in the absence of stimulus. Moreover, the skin secretion from freshly collected anuran was analyzed. This skin secretion solution was lyophilized, resuspended and filtered in membrane cut-off filters (10 kDa). In this study, only the fraction under 10 kDa was used. The material was analyzed by liquid chromatography (RP – HPLC) and mass spectrometry. After chromatographic analyzes, we observe that the secretions solutions showed similar chromatographic profile, regardless of stimulus (chemical or mechanical) or if anurans were recently collected or being acclimated in the laboratory. Also, it was possible to observe that P. carvalhoi presented a basal level of this secretion in its skin. Spectrometry analysis reveals that both stimulation (chemically or mechanically) present the same main molecules (same m/z), showing that this skin secretion have a group of molecules that did not vary as a function of collection. In addition to this, these results show the efficacy of mechanical stimulation to obtain the material. A total of 14 fractions were obtained from skin secretion by RP-HPLC, and each one was analyzed by mass spectrometry (ESI – IT – TOF) and tested for antimicrobial assay. No fraction shoed to contain of peptides, only low molecular mass molecules (< 800 Da). Antimicrobials assays show that fraction 11 decreased the growth of gram-positive bacteria (circa 95 %). When reanalyzed by RP - HPLC, fraction 11 was subdivided in 9 fractions (11.1 - 11.9). Fractions 11.7 - 11.8 were effective again against gram-positive bacteria. Mass spectrometric analyses reveal that fractions 11.6 - 11.8 contain the same ions (m/z 577 Da), suggesting the presence of isomers. This molecule could be responsible for protecting the animal from bacterial infections, as magainins or others antimicrobials peptides do in Xenopus. The major peak present in this skin secretion (m/z 188) was purified, submitted to structural characterization (NMR) and identified as Kynurenic Acid; nevertheless, no biological activity has been identified yet.
Abstract in Portuguese
A busca por novas moléculas com atividades biológicas e/ou aplicações biotecnológicas cresce atualmente, principalmente moléculas ativas contra microrganismos. Em função disto, os peptídeos vêm sendo estudados, principalmente pelo fato de que a ação antimicrobiana se deve a interações físicoquímicas com a membrana bacteriana, levando a uma menor chance de a bactéria desenvolver resistência. Sendo assim, vários animais vêm sendo estudados, dentre eles os anfíbios, os quais são capazes de sintetizar e secretar diferentes classes de moléculas, como alcaloides, esteroides, peptídeos e proteínas. Após a descoberta das Magaininas, peptídeos antimicrobianos presentes na secreção cutânea de Xenopus laevis, cresceram a procura por outros peptídeos antimicrobianos nos anfíbios. Devido à relação evolucionária com o X. laevis, nós analisamos bioquimicamente a secreção cutânea do anuro Pipa carvalhoi, inicialmente procurando identificar a presença de peptídeos antimicrobianos. A secreção cutânea de P. carvalhoi foi obtida através da estimulação química (administrando cloridrato de noradrenalina 1 ou 50 nmol/g), mecânica ou na ausência de estímulo. Obteve-se também a secreção de anuros recém-coletados e trazidos para o biotério. As secreções foram liofilizadas, ressuspendidas e filtradas em membranas de corte molecular (10 kDa). Somente utilizou-se neste estudo a fração menor que 10 kDa. Este material foi analisado através da cromatografia líquida (RP – HPLC) e da espectrometria de massas. Após as análises cromatográficas, as secreções coletadas apresentaram perfis cromatográficos semelhantes, independente de estímulo químico ou mecânico ou se o animal era recém-coletado ou se já estava aclimatado no biotério. A comparação dos cromatogramas sugere que P. carvalhoi é capaz de secretar, na sua pele, níveis basais dos principais componentes. Nas análises por espectrometria de massas, os materiais obtidos tanto pela estimulação mecânica quanto química mostraram possuir as mesmas moléculas majoritárias (mesmas relações m/z), evidenciando que na secreção existe um grupo de moléculas que não varia em função da coleta. Além disto, corrobora a eficácia da utilização da estimulação mecânica para a obtenção do material, preferencialmente à estimulação química. A secreção cutânea foi fracionada em 14 frações por RP– HPLC, sendo estas analisadas por espectrometria de massas (ESI – IT – TOF) e testadas em ensaios antimicrobianos. As análises não identificaram a presença de peptídeos, sendo encontradas somente moléculas de baixa massa molecular (< 800 Da). Entre os vários testes biológicos realizados, a fração 11 foi capaz de reduzir o crescimento microbiano de bactérias gram-positivas (aproximadamente 95 %). Quando reanalisada por RP – HPLC, a fração 11 foi subdividida em 9 frações (11.1 - 11.9). As frações 11.7 - 11.8 foram efetivas novamente em bactérias gram-positivas. Nas análises por espectrometria de massas, foi observado que as frações 11.6 – 11.8 contêm as mesmas relações m/z (m/z 577 Da), sugerindo que se trata de isômeros. Esta molécula possivelmente protege o animal contra as infecções bacterianas, como a exemplo das magaininas ou outros peptídeos antimicrobianos em X. laevis. O pico majoritário da secreção de P. carvalhoi (m/z 188) foi purificado e submetido à caracterização estrutural (NMR), sendo identificado como ácido quinurênico. No entanto, neste estudo, ainda não foi possível associar um efeito biológico ao ácido quinurênico.
Reference
MARIANO, Douglas Oscar Ceolin. Análise do conteúdo da secreção cutânea do anuro Pipa carvalhoi a procura de possíveis moléculas com atividades biológicas relevantes. 2014. 102 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2014.
Mariano, DOC. Participação dos receptores purinérgicos na ação estimulatória da crotoxina sobre a produção de espécies reativas do oxigênio por linhagem de monócito humano (THP-1) [Analysis of the skin secretion of the anura Pipa carvalhoi searching for new molecules with relevant biological] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2014. 102 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3332
Issue Date
2014


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