Análise do possível efeito de componentes da secreção cutânea de Leptodactylus labyrinthicus como interferentes na penetração do vírus da raiva em células de mamíferos

Translated title
Analysis of the possible effect of components from Leptodactylus labyrinthicus skin secretion as interferents on the rabies virus penetration in mammalian cells

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
Appears in Collections:
Abstract
Rabies is a zoonosis distributed worldwide responsible for approximately 55 thousands deaths per year. It is characterized as a lethal progressive acute encephalitis, caused by a virus (Rabies virus; RABV), which replicates in muscular tissues, with subsequent migration to nerve endings possibly mediated by acetylcholine receptors. Similar to other therapeutic classes, molecules with antiviral effects may be present in different organisms, whose toxins, poisons and secretions have been studied as sources of new bioactive substances. In the amphibian’s case, their skin and skin secretions contain a great diversity and variety of bioactive molecules, such as alkaloids, steroids, peptides and proteins, among others. The skin secretion of the anuran Leptodactylus labyrinthicus contains different molecules with biological activity as leptodactyline, pentadactylin and fallaxin. In face of the necessity of new therapeutic approaches for the rabies treatment, this study evaluated whether molecules obtained from the skin secretion of L. labyrinthicus could interfere on the RABV infection in Baby Hamster Kidney (BHK-21) cells line. The skin secretion of L. labyrinthicus was mechanically obtained by compressing the animal submerged in water. This secretion solution was lyophilized, ressuspended in appropriated buffer and filtered in 10 kilodalton (KDa) cut-off membranes. The content retained in the filter was submitted to electrophoresis in polyacrylamide gel. The filtered content was fractionated by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), using a C18 monolithic column and fractions were assayed for cytotoxic and antiviral activity - in BHK-21 cells. After verifying that no fraction was cytotoxic, the evaluation of the possible effect of these fractions on RABV penetration, Pasteur virus (PV) fixed strain, was assessed through tests based on Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). Electrophoretic analysis showed the presence of proteins in the skin secretion of these anurans. From the sixteen fractions obtained, one fraction was able to reduce PV strain infection in BHK-21 cells. Mass spectrometric analyses showed that this fraction contains an antimicrobial peptide named fallaxin, besides low molecular mass molecules. Analogues of this peptide were chemically synthesized by solid phase and assayed in the same models; however, no activity was observed. The active fraction and the synthetic analogues were tested in association with bufotenin, an alkaloid with antiviral effect obtained from the skin secretion of Rhinella jimi. In the virological tests performed with the association of these molecules complete RABV infection inhibition could be observed, pointing out to a synergistic effect between the antibiotic peptide and the alkaloid.
metadata.dc.description.abstractpt
A raiva é uma zoonose mundialmente distribuída responsável pela morte de aproximadamente 55 mil pessoas por ano. É caracterizada como uma encefalite progressiva aguda e letal, causada por um vírus (Rabies virus; RABV) que se replica nos tecidos musculares, com subsequente migração para terminações nervosas, possivelmente, mediada por receptores de acetilcolina. Assim como em outras classes terapêuticas, moléculas com efeitos antivirais podem estar presentes em diferentes organismos, cujas toxinas, venenos e secreções vêm sendo estudadas como fontes de novas substâncias bioativas. No caso dos anfíbios, a pele e a secreção cutânea destes contêm grande diversidade e variedade de moléculas bioativas, como alcaloides, esteroides, peptídeos e proteínas, entre outros. A secreção cutânea do anuro Leptodactylus labyrinthicus possui diferentes moléculas com atividade biológica, como a leptodactilina, a pentadactilina e a falaxina. Devido à necessidade de novas abordagens terapêuticas para o tratamento da raiva, este estudo avaliou se moléculas obtidas a partir da secreção cutânea de L. labyrinthicus poderiam interferir na infecção do RABV em células da linhagem Baby Hamster Kidney (BHK-21). A secreção cutânea de L. labyrinthicus foi mecanicamente obtida por compressão do animal submerso em água. Esta solução de secreção foi liofilizada, ressuspendida em tampão apropriado e filtrada em membranas de corte molecular de 10 quilodaltons (KDa). O conteúdo retido no filtro foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida. O conteúdo filtrado foi fracionado por cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC), utilizando uma coluna monolítica C18, e as frações foram ensaiadas para atividade citotóxica e antiviral – em células BKH-21. Após a constatação de que nenhuma fração foi citotóxica, a avaliação do possível efeito destas frações na penetração da cepa de vírus fixo Pasteur virus (PV) do RABV foi feita através de testes baseados no Teste Rápido de Inibição de Focos Fluorescentes (RFFIT). A análise eletroforética mostrou a presença de proteínas na secreção cutânea destes anuros. Das dezesseis frações obtidas, uma fração foi capaz de diminuir a infecção da cepa PV nas células BHK21. Análises por espectrometria de massas mostraram que esta fração contém um peptídeo antimicrobiano chamado falaxina, além de moléculas de baixa massa molecular. Análogos deste peptídeo foram quimicamente sintetizados, em fase sólida, e ensaiados nos mesmos modelos, porém não tiveram atividade. A fração ativa e os análogos sintéticos foram testados em associação com a bufotenina, um alcaloide com efeito antiviral obtido a partir da secreção cutânea de Rhinella jimi. Nos testes virológicos realizados com as combinações destas moléculas uma completa inibição da infecção pelo RABV pôde ser observada, sugerindo um efeito sinérgico entre o peptídeo antibiótico e o alcaloide.
Reference
CUNHA NETO, Rene dos Santos. Análise do possível efeito de componentes da secreção cutânea de Leptodactylus labyrinthicus como interferentes na penetração do vírus da raiva em células de mamíferos. 2014. 79 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2014.
Cunha Neto RS. Análise do possível efeito de componentes da secreção cutânea de Leptodactylus labyrinthicus como interferentes na penetração do vírus da raiva em células de mamíferos [Analysis of the possible effect of components from Leptodactylus labyrinthicus skin secretion as interferents on the rabies virus penetration in mammalian cells] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2014. 79 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3336
Issue Date
2014


Files in This Item:

149.pdf
Size: 2.57 MB
Format: Adobe PDF
View/Open
Show full item record

The access to the publications deposited in this repository respects the licenses from journals and publishers.