Estudo de venenos de serpentes do complexo Bothrops, uma comparação da filogenia e da reatividade com antivenenos

Translated title
Caracterization of the microvescles present in Crotalus durissus terrificus venom

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
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Abstract
Frequently the venom composition has been considered as a reflex of snake phylogeny, with important implications for the production of antivenoms and treatment of envenomings. Snakes from Bothrops complex are responsible for most snake bites registered in Brazil, and their phylogenetic relationships are not yet completely clarified. Another important discussion is related to the efficacy of Bothrops Antivenom (SAB) in the treatment of envenoming by snakes whose venoms are not present in the immunization pool. Thus, the aim of this study was to analyze the composition of venoms from 6 species of snakes from Bothrops complex, and their correlation with snake phylogeny and reactivity with o SAB. In this way, venoms from Bothropoides jararaca, Bothropoides neuwiedi, Bothrops atrox, Bothrops jararacussu, Rhinocerophis cotiara and Rhinocerophis alternatus were analyzed by SDS-PAGE and reverse phase chromatography on HPLC C18 column. The reactivity of SAB with venoms and their fractions was performed by ELISA and western blot, followed by assessment of neutralization of lethality and hemorrhagic activity of the venoms of B. jararaca (present in immunization pool of SAB) and B. atrox (absent from the pool). The venoms showed distinct electrophoretic and chromatographic profiles, without apparent correlation with the snake phylogeny. Only venoms of the genus Rhinocerophis (R. alternatus and R. cotiara) showed relatively similar profiles. SAB recognized the venoms of different species with the same antibody titer of 640,000. Most of the fractions eluted from C18 column were recognized by SAB, especially those corresponding to snake venom metalloproteinases (SVMP) of class P-III. By SDS-PAGE, the venom of B. jararacussu presented the more distinct electrophoretic profile with predominance of phospholipase A2 (PLA2), while in the other venoms, the SVMPs were the predominant component. Two microlitters of antivenom were sufficient to protect 100 % of mice challenged with 3 LD50 of B. jararaca venom (105 µg), although for B. atrox venom (225 µg) the same effect was only obtained when doubling the antivenom amount. However, the SAB neutralized completely the hemorrhage induced by 10 µg of the both venoms, with the same volume of serum (4 µL). Thus, we conclude that SAB reacts similarly with 16 the same family of toxins from distinct venoms, regardless of the phylogeny of the snake or the presence of venom in the immunization pool employed in SAB production. This suggests that a Bothrops antivenom with greater efficiency and broad spectrum can be developed, if one considers the reactivity of antivenom to the different classes of toxins and not just the phylogeny of snakes.
Abstract in Portuguese
Frequentemente a composição dos venenos tem sido considerada com um reflexo da filogenia das serpentes, com importantes implicações para a produção de antivenenos. As serpentes do complexo Bothrops são responsáveis pela grande maioria dos acidentes ofídicos registrados no Brasil e suas relações filogenéticas ainda não foram completamente esclarecidas. Outra discussão importante diz respeito à eficácia do Soro Antibotrópico (SAB) no tratamento dos envenenamentos ocasionados por serpentes cujos venenos não fazem parte do pool de imunização, utilizado em sua produção. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar a composição dos venenos de 6 espécies de serpentes do complexo Bothrops e sua correlação com a filogenia da serpente e reatividade com o SAB. Para tanto, venenos de Bothropoides jararaca, Bothropoides neuwiedi, Bothrops jararacussu, Bothrops atrox, Rhinocerophis alternatus e Rhinocerophis cotiara foram analisados por SDS-PAGE e cromatografia de fase reversa em HPLC usando coluna C18. A reatividade do SAB com os venenos e suas frações foi analisada por ELISA e Western blotting, seguida por testes de neutralização da letalidade e da atividade hemorrágica induzida pelos venenos de B. jararaca (presente no pool de imunização do SAB) e B. atrox (ausente do pool). Os venenos mostraram distintos perfis eletroforéticos e cromatográficos, sem correlação aparente com a filogenia da serpente. Somente os venenos do gênero Rhinocerophis (R. alternatus e R. cotira) exibiram perfis relativamente semelhantes. O SAB reconheceu os venenos das seis espécies com um mesmo título de anticorpos (640.000). A maioria das frações eluídas da coluna C18 foram reconhecidas pelo SAB, principalmente as correspondentes à Metaloproteinases de Venenos de Serpentes (SVMPs) da classe P-III. Por SDS-PAGE, o veneno de B. jararacussu apresentou o perfil eletroforético mais distinto com predominância de PLA2, enquanto nos outros venenos as SVMPs foram os componentes predominantes. Dois microlitros de antiveneno foram suficientes para proteger 100 % dos camundongos desafiados com 3DL50 do veneno de B. jararaca (105 µg), embora para B. atrox (225 µg) o mesmo efeito tenha sido 14 obtido somente com o dobro do volume de antiveneno. Entretanto, o SAB neutralizou completamente a hemorragia induzida por 10 µg de ambos os venenos com um mesmo volume de soro (4 µL). Portanto, concluímos que o SAB reage similarmente com uma mesma família de toxinas de venenos distintos, independentemente da filogenia da serpente ou mesmo da presença do veneno no pool de imunização. Isso sugere que um antiveneno botrópico de maior espectro e eficiência pode ser desenvolvido, se for considerada a reatividade do antiveneno frente às diversas classes de toxinas e não apenas a filogenia da serpente.
Reference
SOUSA, Leijiane Figueira de. Estudo de venenos de serpentes do complexo Bothrops, uma comparação da filogenia e da reatividade com antivenenos. 2014. 105 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2014.
Souza LF. Estudo de venenos de serpentes do complexo Bothrops, uma comparação da filogenia e da reatividade com antivenenos [Biological activities of Bothrops atrox snake venom captured at Floresta Nacional do Tapajós, Western Pará] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2014. 105 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3340
Issue Date
2014


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