Clonagem e expressão de anticorpos recombinantes de cadeia única (scFvs) anti-crotoxina: original e mutantes sugeridos por modelagem molecular

Acidentes com serpentes são um problema de saúde pública. Estima-se que ocorram cerca de 1,8 milhões de envenenamentos por serpentes a cada ano no mundo, resultando em pelo menos 94 mil mortes. Tal problema foi incluído na lista de doenças tropicais negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. Dentre o gêneros causadores de acidentes ofídicos no Brasil, o gênero Crotalus apresenta o maior coeficiente de letalidade. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus (Cdt) é composto por uma mistura de substâncias, dentre elas as toxinas. A toxina majoritária e principal componente tóxico do veneno é denominada crotoxina. É altamente tóxica e é formada por duas subunidades CA e CB. A administração de anticorpos heterólogos tem sido o tratamento de escolha para indivíduos que sofreram acidentes ofídicos. Porém, sua administração pode causar reações de hipersensibilidade, além da sua produção ser lenta e dificultada pela ação de componentes imunossupressores presentes no veneno de Cdt. Atualmente, fragmentos de anticorpos recombinantes estão se tornando alternativas terapêuticas populares para substituição de anticorpos íntegros. Fragmentos variáveis de cadeia única (scFv, do inglês, single chain fragmente variable) são compostos dos domínios VH e VL unidos por um pequeno linker flexível e podem ser úteis como terapia para o envenenamento por serpentes. Anticorpos recombinantes humanos anti-crotoxina foram isolados previamente de uma biblioteca naive de mais 1010scFvs pela tecnologia de phage display. O objetivo desse estudo foi a expressão de scFvs anticrotoxina original e mutantes sugeridos por modelagem molecular. Um modelo 3D do scFv6 foi construído por modelagem in silico. Docking e cálculos de minimização de energia do complexo anticorpo-CTX também foram realizados. A partir dessas simulações, três mutações foram escolhidas. Os mutantes S30A e Y31F apresentam mutação no CDR H2 e o mutante R103H no CDR H3. O primeiro mutante (S30A) foi obtido por mutagênese sitio dirigida, enquanto os outros dois (Y31Fe R103H) foram obtidos através de genes sintéticos. O scFv original e os mutantes foram clonados em vetor pET20b+ e expressos em E.coli C43(DE3), resultando em proteínas solúveis de aproximadamente 30 kDa. A indução foi feita com IPTG. Após a lise bacteriana, o conteúdo foi purificado por IMAC. A presença das mutações desejadas foi confirmada por sequenciamento. A estrutura secundária dos scFvs foi avaliada por dicroísmo circular e se mostrou preservada. Concluímos que tanto o scFv original como os mutantes foram clonados e expressos com sucesso na forma solúvel. Todos os scFvs apresentaram rendimentos similares após a etapa de purificação. Além disto, os scFvs apresentaram estrutura secundária preservada, conforme avaliado por dicroísmo circular.
Keywords
Veneno de serpente;  Envenenamento;  Crotoxina;  Anticorpos recombinantes;  scFv;  Snake venom;  Poisoning;  Crotoxin;  Recombinant antibodies

Other Titles
Cloning and expression of recombinant single chain antibodies (scFv) anti-crotoxin: original and mutants suggested by molecular modeling
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Thesis
Advisor
Fernandes, Irene
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2014
Metrics
Rights
Open Access
URI

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