Construção e caracterização de uma molécula recombinante híbrida (disintegrina/fosfolipase D) e avaliação de sua atividade biológica

As fosfolipases D (FLDs) do veneno da aranha Loxosceles gaucho são as principais toxinas responsáveis pelos efeitos observados no envenenamento. Estas toxinas podem exercer uma elevada atividade hidrolítica em esfingomielinas, liberando ceramida 1-fosfato (C1P) e fosfatos cíclicos (cPA). O cPA afeta numerosas funções celulares, incluindo a inibição da invasão de células tumorais e metástases. Esta caracteristica poderia ser interessante para utilização biotenológica, no entanto, FLDs promovem forte agregação plaquetária. Por outro lado, as disintegrinas presentes nos venenos de serpentes Viperidae são capazes de inibir a agregação plaquetária e podem se ligar às células tumorais devido à sua capacidade de interagir com as integrinas (αvβ3) altamente expressas nestas células. Assim, a fusão de uma disintegrina de serpente com uma FLD de aranha pode ser uma abordagem interessante para eliminar a agregação plaquetária indesejada provocada pela FLD, e ainda funcionar como uma carreadora desta toxina para células tumorais. Desta forma, visando explorar o potencial antitumoral de uma FLD de L. gaucho denominada LgRec1 e a particularidade de uma disintegrina de serpente E. carinatus denominada Echistatina de se ligar as células tumorais, realizamos a construção de uma toxina híbrida composta pela fusão dessas duas moléculas que foi denominada de Rechistatina. Esta sequência foi clonada no vector pAE e transformada em bactéria BL21 (DE3) para expressão proteica, que foi então purificada por IMAC. A massa molecular e a estrutura secundária da molécula híbrida foram analisadas por espectrometria de massas e dicroísmo circular, respectivamente. A agregação plaquetária foi medida por ensaio de agregometria, e a citotoxicidade da Rechistatina foi analisada em células tumorais. Os resultados mostraram que a molécula híbrida foi clonada e expressa com êxito na forma solúvel. A Rechistatina mostrou uma massa esperada de 38 kDa como confirmado por espectrometria de massa. O dicroísmo circular revelou um padrão de conformação esperado. A fusão de Echistatin a LgRec1 foi eficaz para abolir as propriedades de agregação da FLD LgRec1 e testes de ELISA em células mostraram que a Echistatina foi eficiente em direcionar a LgRec1 à celulas tumorais U87-MG e RD. Adicionalmente, os resultados mostraram que a Rechistatina exerce citotoxicidade nas células U87-MG e RD dose dependente. Em conjunto, estes resultados indicam que a fusão de Echistatina com LgRec1 não prejudicou a atividade biológica da toxina quimérica e foi eficaz para abolir a forte agregação plaquetária da LgRec1. Além disso, a Echistatina foi eficiente em direcionar a LgRec1 às células tumorias, promovendo atividade citotóxica.
Keywords
Disintegrina|\fosfolipase D;  toxina;  Disintegrin;  phospholipase D;  toxin

Other Titles
Construction and characterization of a hybrid recombinant molecule (disintegrin / phospholipase D) and evaluation of its biological activity
metadata.dc.contributor
metadata.dc.description.sponsorship
Document type
Master's thesis
Advisor
Magalhães , Geraldo Santana
Level
Mestrado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTox)
Submission Date
2017
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Open Access
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