Atividade da crotamina e seus derivativos em membranas internas celulares

Translated title
Cell-Penetrating Peptides, crotamine, synthetic protein, internal membranes and intracellular targets

Publication type
Doctoral dissertation
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
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Abstract
Crotamine (nCrot) is a polypeptide composed of 42 amino acid residues from the venom of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus). Previously, our group described nCrot as a CPP (Cell-Penetrating Peptide), since it has the ability to rapidly penetrate into different cell types through the cell membrane lipid barrier. The ability of CPPs to cross plasma membranes has been utilized for several applications, including the delivery of bioactive molecules to inhibit cellular mechanisms involved in several diseases. The feature of nCrot as CPP is directed mainly by dividing cells, which proposes tumor cells as targets. Following this idea, the aim was to evaluate its ability to carry the pro-apoptotic BAX protein into tumor cells. Thus, seven peptides were synthesized from the nCrot sequence, six of these conjugated to BAX. The peptides carried BAX into the tumor cells tested (murine/ human melanoma and human mammary tumor), four of them were capable of significantly reducing cell viability, causing morphological changes, alteration in proapoptotic proteins expression, and inducing hyperpolarization of the mitochondrial membrane resulting in apoptosis and necrosis. By hypothesis, the actions of nCrot may be related to its inhibitory capacity on the K(V)1.3 channel. The high expression of this channel is observed in several cancers, including melanoma, breast cancer, prostate, pancreas, among others. In order to evaluate its action in a pancreatic cancer model, synthetic crotamine (sCrot) was used in different biochemical aspects of pancreatic tumor cells and it was observed that sCrot did not influence cell viability and did not induce phenotypic changes when analyzed HuR protein, which is related to tumor cell survival and resistance of chemotherapeutic drugs. Finally, nCrot and sCrot CPP activity was investigated in human melanoma cells, murine melanoma, breast tumor, human T lymphocytes from leukemia, human mononuclear cells, murine fibroblasts and human keratinocytes. sCrot and nCrot demonstrated the ability to rapidly penetrate into different cells, showing preference for tumor cells. The assay was performed at different time points and in real time on the living cells for 24 hours at time-lapse. In addition, co-localization of sCrot with internal membranes was evaluated, and the result demonstrated co-localization >80% in tumor cells, in contrast to <30% in non-tumor cells, suggesting selectivity by molecular targets in tumors. Also, low cytotoxicity was observed after treatment with sCrot and nCrot, which suggests the future use of sCrot as a molecular probe for labeling tumor cells in vivo, or to delivery molecules which present activity on selective intracellular targets.
metadata.dc.description.abstractpt
A crotamina (nCrot) é um polipeptídio composto de 42 resíduos de aminoácidos, do veneno da cascavel da América do Sul (Crotalus durissus terrificus). Previamente, nosso grupo descreveu a nCrot como um CPP (do inglês, Cell-Penetrating Peptide), uma vez que esta possui capacidade de penetrar rapidamente em diferentes tipos de células atravessando a barreira lipídica da membrana celular. A capacidade dos CPPs de atravessar as membranas plasmáticas tem sido utilizada para várias aplicações, incluindo a entrega de moléculas bioativas para inibir mecanismos celulares envolvido em diversas doenças. A característica da nCrot como CPP é direcionada principalmente por células em divisão, o que propõe células tumorais como alvo. A partir desta ideia, o objetivo foi avaliar sua capacidade de carrear a proteína pró-apoptótica BAX para o interior de células tumorais. Assim, sete peptídeos foram sintetizados a partir da sequência da nCrot, sendo seis destes conjugados com BAX. Os peptídeos carrearam BAX para o interior das células tumorais testadas (melanoma murino/humano e tumor de mama humano) sendo 4 destes, capazes de diminuir significativamente a viabilidade celular, além de causarem mudanças morfológicas, alterações na expressão de proteínas pró-apoptóticas e induzirem hiperpolarização da membrana mitocondrial resultando em apoptose e necrose. Por hipótese, as ações da nCrot podem estar relacionadas à sua capacidade inibitória sobre o canal K(V)1.3. A alta expressão deste canal é observada em vários canceres, incluindo melanoma, câncer de mama, próstata, pâncreas, entre outros. A fim de avaliar sua ação em modelo de câncer de pâncreas, foi utilizada a crotamina sintética (sCrot) em diferentes aspectos bioquímicos das células tumorais de pâncreas e foi observado que a mesma não influenciou na viabilidade celular, e não induziu mudanças fenotípicas quando analisada a proteína HuR, que está relacionada com a sobrevivência da célula tumoral e a resistência de drogas quimioterápicas. Por fim, a atividade CPP da nCrot e sCrot foi investigada em células de melanoma humano, melanoma murino, tumor de mama, linfócitos T humanos provenientes de leucemia, células mononucleares humanas, fibroblastos murino e queratinócitos humanos. sCrot e nCrot demonstraram capacidade de penetrar rapidamente em diferentes celulares, mostrando preferência por células tumorais. O teste foi realizado em diferentes tempos e em tempo real nas células vivas por 24 horas em time-lapse. Ademais, foi avaliada a co-localização da sCrot com membranas internas, e o resultado demonstrou uma co-localização >80% em células tumorais, em contraste com <30% em células não-tumorais, sugerindo a seletividade por alvos moleculares em tumores. Também, foi observada baixa citotoxicidade após tratamento com sCrot e nCrot, o que sugere a futura utilização da sCrot como uma sonda molecular para a marcação das células tumorais in vivo, ou ainda para a entrega de moléculas que tenha ação sobre os alvos intracelulares seletivos.
Reference
LISBOA, Nicole Caroline Mambelli . Atividade da crotamina e seus derivativos em membranas internas celulares. 2017. 146 p. Tese (Doutorado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2017.
Lisboa NCM. Atividade da crotamina e seus derivativos em membranas internas celulares [Cell-Penetrating Peptides, crotamine, synthetic protein, internal membranes and intracellular targets] [Doctoral dissertation]. São Paulo: Instituto Butantan; 2017. 146 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3383
Issue Date
2017


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