Reação inflamatória induzida por duas SVMPs isoladas do veneno de Bothrops atrox e por fragmentos peptídicos gerados da hidrólise de componentes da membrana basal por estas enzimas

Translated title
Inflammatory reaction induced by two metalloproteinases isolated from Bothrops atrox venom and by fragments generated from the hydrolysis of basement membrane components

Publication type
Doctoral dissertation
Language
Portuguese
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Open Access
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Abstract
Snake venom metalloproteases (SVMPs) are key toxins in local and systemic effects observed in victims of snakebites. The mechanisms involved in SVMPs action are related to the hydrolysis of blood vessels basement membrane components (BM), well as their direct action on platelets, endothelial and inflammatory cell receptors, and coagulation factors. Some evidence suggests that endogenous factors derived from BM hydrolysis increase the local effects induced by SVMPs and, consequently, the severity of snakebites. In this study we evaluated the role of two SVMPs of class P-I and P-III named Atroxlysin-Ia (ATXL) and Batroxrhagin (BATXH), respectively, isolated from the Bothrops atrox venom, and its hydrolysis products on Matrigel in experimental models of inflammation. Both toxins induced inflammatory reactions in mice models. The edema formed in the mice paws after the injection of different doses of SVMPs did not indicate a statistical difference between the tested doses or between the toxins. The lesions were similar despite the ATXL having a lower molecular mass than BATXH. In the kinetics tests of edema and accumulation of peritoneal leukocytes, a dose of 2 µg / animal was used. Both toxins induced the formation of an edema peak between 30 min and 1 h, with a 70% increase in the size of the paws. ATXL and BATXH induced an increase in leukocyte influx 4 h after intraperitoneal injection. For the evaluation of possible inflammatory mediators involved in these reactions, we stimulated Murine Peritoneal Adherent Cells (MPACs) with 40 µg / mL of the SVMPs or B. atrox venom in different time´s period. The cytokine TNF-α was identified in the supernatant of cells stimulated with BATXH or with B. atrox. The venom peaked between 2 h and 6 h with levels of 800 pg/mL, and BATXH induces secretion of 200 pg/mL in 4 h. The same was not observed with ATXL. To test the hypothesis that peptides resulting from MB hydrolysis by SVMPs could participate in the inflammatory process, Matrigel was incubated with the toxins for 1 h at 37 ° C, and the hydrolysis products were identified by LC-MS/MS. In parallel, peptides resulting from this incubation were isolated on centrifugal filters with a 10 kDa cut off. The reaction generated different fragments, mainly Laminin peptides. Isolated peptides in the filters induced the formation of edema with a 30% increase in the size of the paws and promoted leukocyte accumulation in the peritoneal cavity (4-5 x 106 cells/mL). Thus, the results suggest that ATXL and BATXH, together with peptides resulting from Matrigel´s hydrolysis, play an important role in inflammatory reaction observed in envenoming by B. atrox. Generally, envenoming causes irreversible local injuries, even after the administration of antivenom. In this context, we present tests with two inhibitors derived from the Jararhagin pro-domain that were able to neutralize the catalytic, fibrinolytic and hemorrhagic activity induced by SVMP, indicating a possible complementary treatment with antibotropic serum.
metadata.dc.description.abstractpt
Metaloproteases do veneno de serpentes (SVMPs) são toxinas chave nos efeitos locais e sistêmicos observados em vítimas de acidentes ofídicos. Os mecanismos envolvidos na ação das SVMPs estão relacionados à hidrólise dos componentes da membrana basal (MB) dos vasos sanguíneos, bem como à sua ação direta sobre plaquetas, receptores de células endoteliais e inflamatórias, e fatores de coagulação. Algumas evidências sugerem que fatores endógenos derivados da hidrólise de MB aumentam os efeitos locais induzidos pelas SVMPs e, consequentemente, a gravidade dos acidentes ofídicos. Neste trabalho avaliamos o papel de duas SVMPs de classe P-I e P-III nomeadas Atroxlisina-Ia (ATXL) e Batroxragina (BATXH), respectivamente, isoladas do veneno de Bothrops atrox, e seus produtos de hidrólise sobre o Matrigel em modelos experimentais de inflamação. As duas toxinas induziram reação inflamatória em modelos murinos. O edema formado nas patas de camundongos após a injeção de diferentes doses das SVMPs não indicou diferença estatística entre as doses testadas nem entre as toxinas. As lesões foram semelhantes apesar da ATXL possuir massa molecular menor que BATXH. Nos testes de cinética do edema e acúmulo de leucócitos peritoneais foi utilizada a dose de 2 µg/animal. Ambas as toxinas induziram a formação de um pico de edema entre 30 min e 1 h, com aumento de 70% no tamanho das patas. ATXL e BATXH induziram aumento do influxo leucocitário a partir de 4 h após injeção intraperitoneal. Para a avaliação de possíveis mediadores inflamatórios envolvidos nestas reações, estimulamos Células Aderentes Peritoneais Murinas (MPACs) com 40 µg/mL das SVMPs ou veneno de B. atrox em diferentes períodos de tempo. A citocina TNF-α foi identificada no sobrenadante de células estimuladas com BATXH ou com veneno de B. atrox. O veneno atingiu um pico entre 2 h e 6 h com níveis de 800 pg/mL, e BATXH induziu secreção de 200 pg/mL em 4 h. O mesmo não foi observado com ATXL. Para testar a hipótese de que os peptídeos resultantes da hidrólise de MB pelas SVMPs poderiam participar do processo inflamatório, Matrigel foi incubado com as toxinas durante 1 h a 37 °C, e os produtos de hidrólise foram identificados por LC-MS/MS. Paralelamente, peptídeos resultantes desta incubação foram isolados em filtros centrífugos com corte de 10 kDa. A reação gerou diferentes fragmentos, principalmente peptídeos da Laminina. Peptídeos isolados por filtração induziram a formação de edema com aumento no tamanho das patas de 30%, e promoveram o acúmulo leucocitário na cavidade peritoneal (4-5 x 106 células/mL). Assim, os resultados sugerem que ATXL e BATXH, juntamente com peptídeos resultantes da hidrólise do Matrigel por essas proteases desempenham um papel importante na reação inflamatória observada no envenenamento por B. atrox. Geralmente, o envenenamento causa lesões locais irreversíveis, mesmo após a administração do antiveneneno. Neste contexto, apresentamos testes com dois inibidores derivados do pró-domínio da Jararagina que foram capazes de neutralizar a atividade catalítica, fibrinolítica e hemorrágica induzidas pela SVMP, indicando um possível tratamento complementar com soro antibotrópico.
Reference
ALMEIDA, Michelle Teixeira de. Reação inflamatória induzida por duas SVMPs isoladas do veneno de Bothrops atrox e por fragmentos peptídicos gerados da hidrólise de componentes da membrana basal por estas enzimas. 2020. 81 f. Tese (Doutorado em Ciências - Toxinologia) – Instituto Butantan, São Paulo, 2020.
Almeida MT. Reação inflamatória induzida por duas SVMPs isoladas do veneno de Bothrops atrox e por fragmentos peptídicos gerados da hidrólise de componentes da membrana basal por estas enzimas [Inflammatory reaction induced by two metalloproteinases isolated from Bothrops atrox venom and by fragments generated from the hydrolysis of basement membrane components] [Doctoral dissertation]. [São Paulo]: Instituto Butantan; 2020. 81 p. Portuguese.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3590
Issue Date
2020


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