Avaliação da expressão gênica diferencial e da histopatologia de diferentes órgãos de camundongos em resposta ao envenenamento por Micrurus corallinus

Translated title
Analysis of differential gene expression and histopathology in mice tissues in response to the envenoming caused by Micrurus corallinus

Publication type
Doctoral dissertation
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
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Abstract
Snakes of the Elapidae family possess highly toxic venoms due to the presence of lethal neurotoxins. These venoms are rich, particularly, in two neurotoxic families of proteins: α-neurotoxins and phospholipases A2 (PLA2s). In the American continent, the Elapidae family is represented by the coral snakes group, which includes three genera (Micrurus, Leptomicrurus and Micruroides). Micrurus genus is the most specious among them and M. frontalis and M.corallinus are the most important species in Brazil in terms of public health. Their venoms are employed for the antivenoms production used in micruric envenoming. In the present work, we used RNA-Seq to gain deeper knowledge on the effects of M. corallinus venom, local and systemically, in a mice model injected with sublethal doses of the venom. Tissue samples from the brain, kidney, liver, spleen, heart, diaphragm and both gastrocnemius muscles were collected for total RNA isolation, at 8 and 24 hours after venom injection. Then, cDNA libraries were prepared and the sequencing was run in an Illumina HiSeq1500 instrument. The data obtained from the sequencing were processed by suitable bioinformatic programs. Those genes that changed their expression for a two-fold change cutoff (FDR ≤ 0.05) were submitted to enrichment analyses so as to investigate the affected pathways and networks. On the other hand, histopathological analyses were carried in order to help in the results interpretation. In terms of differential gene expression, the results showed a strong response in the right gastrocnemius, local of venom inoculation. The enrichment analyses identified a myriad of genes involved in pathways and networks related to cell adhesion, chemotaxis and inflammation processes, mainly at 8 hours. These findings were consistent with the histopathological observations, which showed an important leukocyte infiltrate and edema. At 24 hours, in addition to the identification of several pathways and networks involved in inflammatory processes, others related to cell cycle were also noticed, indicating the activation of satellite cells, responsible for the restoration of muscle tissue homeostasis. The systemic effects were more discrete and the liver was the organ exhibiting the greatest alterations among the other tissues and organs studied. Enrichment analyses of liver samples pointed out, at both times, the IL-6 signaling pathway as the most relevant one. In this pathway, normally activated in the presence of inflammatory processes, several up-regulated transcripts coding for acute phase proteins were identified. In addition, toxicity enrichment analyses revealed that a set of genes involved in the xenobiotics metabolism was down-regulated. The other samples studied did not show relevant results in the context of the experimental conditions. High-throughput technologies have been poorly exploited in the “toxicovenomic” field so far. Here, through the combination of a modern technology, RNA-seq, a powerful tool for the study of transcriptomes, bioinformatics programs and a traditional approach, such as histology, it was possible to obtain a comprehensive view of the molecular mechanisms underlying the pathological effects in response to venom of M. corallinus. Keywords: Envenoming, Micrurus corallinus,
metadata.dc.description.abstractpt
As serpentes da família Elapidae possuem venenos altamente neurotóxicos. Estes venenos são ricos, particularmente, em duas famílias de proteínas neurotóxicas: α- neurotoxinas e fosfolipases A2 (PLA2), as quais agem pré e pós-sinapticamente na junção neuromuscular, respectivamente. No continente Americano, a família Elapidae está representada pelo grupo das cobras corais, que inclui três gêneros (Micrurus, Leptomicrurus e Micruroides), sendo o gênero Micrurus o que exibe o maior número de espécies. No Brasil, M. frontalis e M. corallinus são as espécies de maior importância médica, e, em consequência, as usadas para a produção dos soros hiperimunes utilizados nos acidentes micrúricos. O presente trabalho teve como objetivo aprofundar os conhecimentos dos efeitos, locais e sistêmicos, do veneno de M. corallinus quando inoculado em doses subletais em camundongos heterogêneos, por meio de uma análise de expressão gênica diferencial com o uso de RNA-Seq. Para tal, a partir do RNA extraído do cérebro, rim, fígado, baço, coração, diafragma e ambos os músculos gastrocnêmios, em 8 e 24 horas de tratamento, foram preparadas bibliotecas de cDNA e sequenciadas no equipamento Illumina HiSeq1500. Os dados obtidos do sequenciamento foram processados por uma bateria de programas bioinformáticos e os resultados daqueles genes que apresentaram mudanças na expressão gênica foram submetidos a análises de enriquecimento no intuito de investigar as vias e redes moleculares afetadas. Em outra frente, foram realizadas análises histopatológicas para auxiliar na interpretação dos resultados. Em termos de expressão gênica diferencial, os resultados indicaram uma forte resposta no gastrocnêmio direito, lugar da inoculação do veneno. No tratamento de 8 horas, as análises de enriquecimento identificaram uma miríade de genes envolvidos em vias e redes relacionadas a processos de adesão celular, quimiotaxia e inflamação. Estes achados foram condizentes com as observações realizadas por meio das análises histopatológicas, as quais evidenciaram um importante infiltrado leucocitário e edema. Em 24 horas, além de terem sido identificadas várias vias e redes envolvidas em processos inflamatórios, também foram notadas outras relacionadas ao ciclo celular, indicando a ativação das células satélites, responsáveis pelo restabelecimento da homeostase do tecido muscular. Os efeitos sistêmicos foram muito mais discretos, sendo o fígado o órgão que exibiu as maiores alterações dentre os outros tecidos e órgãos avaliados. As análises de enriquecimento das amostras do fígado indicaram, em ambos os tempos, a via de sinalização da IL-6 como a de maior relevância. Nesta via, ativada em presença de processos inflamatórios, foram identificados vários transcritos de proteínas de fase aguda regulados positivamente. Além disso, as análises de toxicidade revelaram que um conjunto de genes envolvidos no metabolismo de xenobióticos encontrou-se regulado negativamente. As outras amostras estudadas não mostraram resultados relevantes no contexto das condições experimentais. As tecnologias High-throughput têm sido pouco exploradas na área da “toxicovenômica”. Neste sentido, adotamos a combinação de uma moderna tecnologia, RNA-seq, poderosa ferramenta para o estudo de transcriptomas, sofisticados programas de bioinformática e uma abordagem tradicional, como a histologia, para obter uma visão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos patológicos desencadeados pelo veneno de M. corallinus.
Reference
EULA, Maria Andrea Camarano. Avaliação da expressão gênica diferencial e da histopatologia de diferentes órgãos de camundongos em resposta ao envenenamento por Micrurus corallinus. 2018. 180 f. Tese (Doutorado em Ciências - Toxinologia). Instituto Butantan, São Paulo, 2018
Eula MAC. Avaliação da expressão gênica diferencial e da histopatologia de diferentes órgãos de camundongos em resposta ao envenenamento por Micrurus corallinus [Analysis of differential gene expression and histopathology in mice tissues in response to the envenoming caused by Micrurus corallinus][Doctoral dissertation]. São Paulo: Instituto Butantan; 2018. 180 p. Portuguese.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3612
Issue Date
2018


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