Cultivos em meios complexos para produção de L-asparaginase em Escherichia coli BL21(DE3)

Translated title
Complex media cultures for L-asparaginase production in Escherichia coli BL21 (DE3)

Abstract
Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is a type of neoplasia that has L-asparaginase as a highly effective treatment. This biopharmaceutical cleaves asparagine and releases ammonium and aspartic acid; this neoplastic cells do not produce asparagine due to their still immature cellular machinery and end up dying in the absence of that amino acid. In Brazil, patients have difficulty in accessing this medicine because it is imported, has a high cost, in addition to problems in supply. Therefore, a group of researchers seeks to develop a national drug, with less allergic potential, therefrom the country will have autonomy, enabling access to the population through SUS. Escherichia coli BL21 (DE3) has been widely used for the expression of heterologous proteins and to reach a high cell density. This work consists of evaluating different complex media, micronutrients and appropriate inducer for the production of recombinant L-asparaginase. For this study was used E.coli BL21 (DE3) containing the expression vector pET28a, with T7 promoter, selection marker for kanamycin and carrying the KY305877 gene sequence. Experiments in stirred flask were performed at 300 rpm, 37 ° C in: Luria Bertani (LB), Semi Defined (SD), Super Broth (SB), Terrific Broth (TB), TB mod., TB mod. + nutrients, TB mod. in different carbon sources, TB mod. in lactose as an inducer. Bioreactor tests were also carried out with the modified TB medium. Samples were collected every hour for analysis of biomass, enzymatic activity and electrophoresis. The TB medium showed the highest DO600nm and enzymatic activity. The tryptone of the TB medium was replaced by soytone, a component of plant origin, and adjusted in its concentration (17 g / L) to achieve similar values in growth and asparaginase activity obtained with the tryptone originating the TB mod medium. In this composition there was no need for micronutrient supplementation. The increment of the TB medium mod. with glucose, glycerol and lactose, with lactose also acting as an inducer, showed promising enzymatic activity in stirred flasks of 5 IU / ml of culture through 6UI / ml of culture with IPTG. The use of IPTG is inappropriate due to the high cost, toxicity and limited monitoring during cultivation, on the other hand, lactose may be introduced in the formulation of the medium together with other components and will act as an inducer, when the glucose runs out, and as a carbon source. This type of medium is known as a self-inducing medium. In a bioreactor the DO600nm reached 39.9 AU with enzymatic activity of 29 IU / Cultivation.
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A Leucemia linfoide aguda (LLA) é um tipo de neoplasia que tem como tratamento altamente eficaz a L-asparaginase. Este biofármaco cliva a asparagina e libera amônio e ácido aspártico; as células neoplásicas que não produzem asparagina devido a sua maquinaria celular ainda imatura acabam morrendo na ausência desse aminoácido. No Brasil, os pacientes têm dificuldade no acesso a esse medicamento por ser importada, de alto custo, além de problemas no fornecimento. Assim, um grupo de pesquisadores buscam desenvolver um medicamento nacional, com menor potencial alérgico, para que o país tenha autonomia, possibilitando o acesso à população através do SUS. A Escherichia coli BL21(DE3) tem sido amplamente utilizada para a expressão de proteínas heterólogas e possibilitar o aumento da densidade celular. Este trabalho consiste em avaliar diferentes meios complexos, os micronutrientes e indutor apropriado para a produção de L-asparaginase recombinante. E.coli BL21(DE3) contendo o vetor de expressão pET28a, com promotor T7, marcador de seleção para Canamicina e carregando a sequência de gene KY305877 foi utilizada. Experimentos em fracos agitados foram realizados a 300 rpm, 37°C em: Luria Bertani (LB), Semi Definido (SD), Super Broth (SB), Terrific Broth (TB), TB mod., TB mod. + nutrientes, TB mod. em diferentes fontes de carbono, TB mod. em lactose como indutor. Foram ainda realizados ensaios em biorreator com o meio TB modificado. Amostras foram coletadas a cada hora para análise de biomassa, atividade enzimática e eletroforese. O meio TB apresentou a maior DO600nm e atividade enzimática. A triptona do meio TB foi substituída por soytone, um componente de origem vegetal, e ajustada na sua quantidade (17 g/L) para atingir valores similares em crescimento e atividade da asparaginase obtida com a triptona originando o meio TB mod. Nesta composição não houve a necessidade de suplementação de micronutrientes. A incrementação do meio TB mod. com glicose, glicerol e lactose, sendo a lactose atuando também como indutor, apresentou atividade enzimática promissor em frascos agitados de 5 UI/Lcultivo mediante a 6UI/Lcultivo com IPTG. O uso IPTG é inadequado devido ao custo elevado, toxicidade e limitação no monitoramento durante o cultivo, por outro lado a lactose poderá ser introduzida na formulação do meio juntamente com demais componentes e atuará como indutor quando a glicose acabar e como fonte de carbono. Este tipo de meio é conhecido como meio de auto-indução. Em biorreator a DO600nm chegou a 39,9 UA com atividade enzimática de 29 UI/Lcultivo.
Reference
Henrique, Izabella de Macedo. Avaliação de parâmetros de cultivo para produção de L-asparaginase por Escherichia coli BL21(DE3). 2020. Trabalho de Conclusão de Curso Biotecnologia para a saúde: Vacinas e Biofármacos – Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP; Instituto Butantan, São Paulo, 2020.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3707
Issue Date
2020


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