Clonagem e expressão da proteína LIPL31 de leptospira interrogans

Translated title
Cloning and expression of LIPL31 protein from leptospira interrogans

Abstract
Leptospira is a genus of Gram-negative bacteria belonging to the order Spirochaetales and family Leptospiraceae. Pathogenic species are responsible for human and veterinary infection called leptospirosis, which affect mainly tropical and subtropical countries, including Brazil. Knowledge of the pathogenicity mechanisms of leptospires is limited and the vaccine is serovar-dependent. The reverse vaccinology has been applied in the study of outer membrane proteins (OMPs) that have the potential to interact with the host components. In this regard, cell localization assays are important assays for screening of OMPs. LipL31, a protein located in the cytoplasmic membrane of leptospires, may be used as an experimental control in validation of these assays. From the sequenced genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, the LIC11456 gene was analyzed in silico, and amplified without peptide signal for cloning into the pAE vector using E. coli DH5α. Recombinant LipL31 was expressed in the strain E. coli DE3 Star pLysS with addition of 1 mM IPTG in LB medium and then purified from the soluble fraction by metal affinity chromatography (Ni2 +). The secondary structure of the recombinant LipL31 was analyzed by circular dichroism as a way of evaluating the structural winding, the recombinant presented 70% of its structure composed by α-helix, which is similar to the predicted in silico data. The protein reproduced localization experiments already performed indicating to be internal, and it is suggested that its more stable oligomeric conformation is in the form of dimer.
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Leptospira é um gênero de bactérias Gram-negativas pertencentes à ordem Spirochaetales e família Leptospiraceae. Espécies patogênicas são responsáveis pela infecção humana e veterinária chamada leptospirose, que afeta principalmente países tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil. O conhecimento dos mecanismos de patogenicidade das leptospiras é limitado e a vacina é sorovar dependente. A vacinologia reversa então foi aplicada no estudo das proteínas da membrana externa (OMPs) que têm o potencial de interagir com os componentes do hospedeiro. A este respeito, os ensaios de localização celular são ensaios importantes para o rastreio de OMPs e a LipL31, uma proteína localizada na membrana citoplasmática das leptospiras, pode ser utilizada como controle experimental na validação desses ensaios. A partir do genoma sequenciado de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, o gene LIC11456 foi analisado in silico, e amplificado sem peptídeo sinal para clonagem no vector pAE utilizando E. coli DH5a. A LipL31 recombinante foi expressa na cepa de E. coli DE3 Star pLysS com adição de 1 mM de IPTG em meio LB e depois purificado a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade com metal (Ni2 +). A estrutura secundária do LipL31 recombinante foi analisada por dicroísmo circular como forma de avaliar o enrolamento estrutural, a recombinante apresentou 70% de sua estrutura composta por a-hélice, que é semelhante aos dados in silico previstos. A proteína reproduziu experimentos de localização já realizados indicando ser interna, e sugere-se que sua conformação oligomérica mais estável seja na forma de dímero.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3784
Issue Date
2019


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