Expressão do peptídeo recombinante Defb-Lm02, uma β-defensina da serpente Lachesis muta

Translated title
Expression of the recombinant peptide Defb-Lm02, a β-defensin from the snake Lachesis muta

Publication type
Academic monograph
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
Abstract
Antimicrobial peptides (AMPs) are components of innate immune system, are present in all living organisms, acting quickly and in unspecific way as a chemical barrier and they have antimicrobial activity. β-defensins is a major family of AMPs with characteristic β- sheet-rich fold, six conserved Cys with particular spacing and intramolecular bonds. They are extensively studied in mammals but scarcely in snakes. The β-defensin Defb-Lm02, of Lachesis muta snake, is codified by a gene structured in three exons and has 38 amino acid residues, molecular weight of 4.6 kDa, net charge of +8 at pH 7 and isoelectric point (pI) of 10.35. The synthetic linear peptide of Defb-Lm02 was tested to antimicrobial activity: it presented the minimum inhibitory concentration against Gram negative bacteria: Escherichia coli 16 μg/mL and Citrobacter freundii 16 μg/mL; and Gram positive: Micrococcus luteus 4 μg/mL and Staphylococcus aureus 32 μg/mL. It did not inhibit the growth of Gram-negative Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri and Morganella morganii until the concentration of 64 μg/mL. These results may be due to the linearity of synthetic peptide. As the defense tasks of β-defensin could be dependent on their 3D structure, the production of recombinant β-defensin may potentiate its antimicrobial activity or suggest a new function. The synthetic gene, maltose binding protein (MBP) – TEV protease recognition site – DefbLm02, was cloned into the pET28a expression vector. The protein was expressed in E. coli BL21 Star and C43, at two temperatures 30 ° C and 37 ° C. After 4 hours of induction with IPTG 1 mM, which showed the best condition of expression was BL21 Star at 30 °C. The major part of fusion protein was soluble after purification by affinity chromatography and after proteolysis. The protein fusion was checked by Western blot using an antibody anti-MBP.
metadata.dc.description.abstractpt
Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) fazem parte do sistema imune inato, presente em praticamente todas as formas de vida, age de maneira rápida e inespecífica, como uma barreira química e possuem atividade antimicrobiana. As β-defensinas são uma importante família de PAMs com características ricas em folhas β, seis Cys conservadas com espaçamento particular e ligações intramoleculares, são extensivamente estudadas em mamíferos, mas raramente em serpentes, e podem refletir uma adaptação de peptídeos de defesa epitelial do hospedeiro. A Defb-Lm02, uma defensina da serpente Lachesis muta, é codificada por um gene estruturado em três exons cuja tradução ao peptídeo maduro consiste em 38 resíduos de aminoácidos, massa molecular de 4,6 kDa, carga líquida de +8 em pH 7, ponto isoelétrico (pI) de 10,35. Esse peptídeo foi sintetizado na forma linear e testado para atividade antimicrobiana, resultando nas seguintes concentrações inibitórias mínima contra bactérias Gram negativa: Escherichia coli 16 μg/mL e Citrobacter freundii 16 μg/mL; contra Gram positiva: Micrococcus luteus 4 μg/mL e Staphylococcus aureus 32 μg/mL. Não inibiu o crescimento das bactérias Gram-negativas Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens, Providencia rettgeri e Morganella morganii até a concentração de 64 μg/mL. Estes resultados podem ser devido à linearidade do peptídeo sintético. Sabemos que algumas atividades biológicas das β-defensinas são dependentes da sua estrutura 3D, portanto, a obtenção dessa toxina na forma recombinante pode potencializar sua atividade antimicrobiana ou até sugerir novas funções. O gene sintético, codificando a fusão proteína de ligação à maltose (MBP) - sítio de reconhecimento da protease TEV – DefbLm02, foi clonado no vetor de expressão pET28a. A proteína de fusão foi expressa em duas cepas de E. coli, BL21 Star e C43, em duas temperaturas, 30°C e 37°C. Após 4 horas de indução com IPTG 1 mM, a combinação BL21 Star e 30°C foi a que apresentou a melhor eficiência de expressão. A maior proporção da proteína foi obtida solúvel após purificação por cromatografia de afinidade, como também após a digestão com TEV. A proteína de fusão foi verificada por Western Blotting, utilizando anticorpo anti-MBP.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3814
Issue Date
2019


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