Caracterização de agonistas de TLR2 na preparação adjuvante de MPLA de Bordetella pertussis

Translated title
Characterization of TLR2 agonists in the adjuvant preparation of MPLA from Bordetella pertussis

Abstract
Production of adjuvants is strategic to increase the world production capacity of vaccines, as well as improve the immune response in case of poor immunogenic antigens, or in case of non-good responders, such as elderly. Adjuvants are particularly beneficial for influenza vaccines during a pandemic, when a rapid response is required. One of the adjuvant that Instituto Butantan has been investigating is derived from the extraction of the lipoligosaccharide (LOS) from Bordetella pertussis, named monophosphoryl lipid A (MPLA). This preparation has been shown to have excellent adjuvant properties, allowing an increase of immune response for influenza antigens, leading to dose sparing of influenza vaccines. Beside the adjuvant properties, our group has demonstrated the activity of this adjuvant preparation through human Toll-like receptor 2 (hTLR2) that is known to recognize primarily lipoproteins. Thus, the aim of this work was to characterize the presence of a possible hTLR2 agonist from our B. pertussis MPLA preparation, distinct from MPLA. For that, the crude extract of LOS, removed from B. pertussis, was submitted to an acid hydrolysis to produce the MPLA preparation. It was submitted to a cation-exchange chromatography to fractionate the MPLA from other molecules like lipoproteins that could be present in the preparation. The collected fractions were tested for (i) hTLR2 stimulation, (ii) organic phosphorus content, indicative of MPLA, (iii) SDS-PAGE, (iv) hTLR2 stimulation remaining and protein remaining by SDS-PAGE after proteolysis, (v) detection of LOS by western blot, endotoxin content, and Kdo content. Two main peaks positive for hTLR2 activation and negative for phosphorus content were eluted from chromatography. The flow-through had 92% less hTLR2 stimulation than the eluted fractions. The SDS-PAGE profile of the eluted fractions showed bands with molecular mass below 17 kDa, which is less than predicted for lipoproteins from B. pertussis (~16-40 kDa), but is enough for hTLR2 stimulation because synthetic TLR2 agonists have less than 2 kDa. Furthermore, after proteolysis we could observe reduction in SDS-PAGE band intensity, and hTLR2 stimulation was also apparently reduced, at least for some fractions. Western blot assays were negative for LOS in the collected fractions, indicating that apparently there was not LOS remaining in the fractions. However, the contents of endotoxin and Kdo relative to input do not decrease uniformly, so these results have to be confirmed. These preliminary results indicate we achieved the separation of MPLA from molecules probably with a protein nature that target hTLR2 activation present in the adjuvant preparation. More experiments are needed to confirm these results and continue improving our knowledge about this potent adjuvant derived from B. pertussis.
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A produção de adjuvantes é uma ação estratégica para se aumentar a capacidade mundial de produção de vacinas, bem como melhorar a resposta imune em casos de indivíduos maus respondedores, como os idosos, ou ainda no caso de antígenos pouco imunogênicos. Adjuvantes são particularmente convenientes para vacinas de influenza durante uma pandemia, já que uma resposta rápida é necessária. Um dos adjuvantes que o Instituto Butantan tem desenvolvido é derivado do lipooligossacarídeo (LOS) de Bordetella pertussis, denominado monofosforil lipídio A (MPLA). Tem sido demonstrado que essa preparação adjuvante tem potencial para aumentar a imunogenicidade de antígenos de influenza, reduzindo significativamente a dose necessária de antígeno para as vacinas influenza. Além disso, nosso grupo tem demonstrado a atividade dessa preparação adjuvante na estimulação do receptor do tipo Toll 2 humano (hTLR2), que reconhece principalmente lipoproteínas. Assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar a presença de um possível agonista de hTLR2 que, além do MPLA, estaria compondo essa preparação adjuvante. Para isso, a preparação de LOS obtida de B. pertussis foi submetida a hidrólise ácida para obtenção da preparação de MPLA. A cromatografia de troca catiônica foi empregada a fim de se fazer o fracionamento entre o MPLA e outras moléculas que poderiam estar presentes na preparação, como lipoproteínas. As frações coletadas foram testadas para (i) estimulação de hTLR2, (ii) conteúdo de fósforo orgânico (quantificação indireta de MPLA), (iii) SDS-PAGE, (iv) estimulação de hTLR2 e remanescente de proteínas por SDS-PAGE após proteólise, (v) detecção de LOS por western blot, conteúdo de endotoxina e de Kdo. Dois picos principais positivos para ativação de hTLR2 e negativos para conteúdo de fósforo foram eluídos na cromatografia. As frações não adsorvidas exibiram uma estimulação de hTLR2 em média 92% menor em comparação com as frações eluídas. O SDS-PAGE das frações eluídas mostrou bandas com massa molecular abaixo de 17 kDa, que é menor que o esperado para lipoproteínas de B. pertussis (~16-40 kDa), mas é suficiente para a estimulação de hTLR2, pois agonistas sintéticos de TLR2 têm menos de 2 kDa. Além disso, após proteólise observamos redução na intensidade dessas bandas e uma aparente diminuição na estimulação de hTLR2, pelo menos para algumas frações. O ensaio de western blot foi negativo para a presença de LOS nas frações coletadas, indicando que aparentemente não havia remanescente de LOS nas frações, no entanto não houve diminuição uniforme no conteúdo de endotoxina ou Kdo comparado à preparação de MPLA; desta forma, esses resultados devem ser confirmados. Os resultados preliminares obtidos indicam que foi possível realizar a separação entre MPLA e moléculas agonistas de hTLR2 provavelmente de natureza proteica presentes na preparação adjuvante. Mais experimentos são necessários para confirmar esses resultados e, assim, aprofundar o conhecimento sobre esse potente adjuvante derivado de B. pertussis.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3823
Issue Date
2019


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