Uso de microfiltração tangencial no processo de purificação do exopolissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo B


Abstract
Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative bacterium, responsible for serious infections, such as pneumonia, sepsis and meningitis, especially in children younger than 5 years old and immunocompromised individuals. The main virulence factor of Hib is its polyribosyl-ribitol-phosphate capsular exopolysaccharide (PRP), which is used in the formulation of Hib vaccines, conjugated to a carrier protein. The production of the conjugated vaccine is complex and costly, particularly the PRP purification process, that comprises several steps of ethanol precipitation and centrifugation, and uses organic solvents and detergents. Targeting a more affordable vaccine that meets the public health systems demands, the Process Development Laboratory of Butantan Institute has been developing a simpler, economical and easily scalable purification process based on tangential flow filtration. In this process, one major bottleneck is the broth clarification step by microfiltration, which results in low PRP recovery and high variability, probably due to membrane fouling. Regarding this matter, a small scale study was previously performed, in order to identify the best operational conditions of relevant process variables, namely transmembrane pressure (TMP), feed flow, and permeate flow. The aim of this work was to scale up the broth clarification step using the defined conditions for these parameters and to perform a critical flux analysis, which is a very useful tool in tangential flow filtration optimization. Although PRP recovery was relatively smaller in the higher scale (68.5% against 97.5%), the permeate flow and TMP profiles were very similar. Analysis of PRP recovery profile indicated that extending dialysis might improve PRP yield. Critical flux of around 35 L.h-1 .m-2 was determined experimentally, which explains the high PRP recovery when a limit permeate flux of 25 L.h-1 .m-2 was employed in the cell clarification step. In conclusion, the process designed for broth clarification is quite promising in terms of product yield and scalability.
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Haemophilus influenzae do tipo b (Hib) é uma bactéria Gram-negativa, responsável por infecções graves, como pneumonia, sepse e meningite, especialmente em crianças menores de 5 anos de idade e indivíduos imunocomprometidos. Seu principal fator de virulência é o exopolissacarídeo capsular de poliribosil-ribitol- fosfato (PRP), que é utilizado na formulação de vacinas contra Hib, conjugado a uma proteína carreadora. A produção da vacina conjugada é complexa e onerosa, principalmente o processo de purificação do PRP, caracterizado por várias etapas de precipitação com etanol, centrifugação e uso de solventes orgânicos e detergentes. Buscando uma vacina mais acessível, que possa atender à demanda de sistemas públicos de saúde, o Laboratório de Desenvolvimento de Processos vem desenvolvendo nos últimos anos um método de purificação mais simples, econômico e facilmente escalonável, baseado em filtração tangencial. Nesse processo, um dos gargalos identificados é a etapa de separação celular por microfiltração, que apresentava baixa recuperação de PRP e alta variabilidade dos resultados, provavelmente relacionados ao fenômeno de fouling. Um estudo em pequena escala foi realizado previamente para identificar as melhores condições de variáveis operacionais relevantes - pressão transmembrana (TMP), fluxo de entrada e fluxo do filtrado. O presente trabalho teve como objetivos escalonar o processo, mantendo essas condições, e realizar uma análise do fluxo crítico do filtrado, ferramenta bastante útil para a otimização da filtração tangencial. Embora a recuperação de PRP tenha sido relativamente menor no processo escalonado (68,5% contra 97,5%), os perfis de fluxo do filtrado e de TMP se mostraram muito semelhantes, e as análises da tendência de recuperação mostram que um aumento no número de diavolumes utilizado pode contornar essa questão. O valor de fluxo crítico determinado experimentalmente foi próximo de 35 L.h-1 .m-2 , o que corrobora os bons resultados obtidos com o uso de fluxo limite de 25 L.h-1 .m-2 para o filtrado no processo de separação celular. Os resultados obtidos mostram que o desenho de processo estabelecido para a clarificação de PRP é bastante promissor em termos de rendimento de PRP e escalabilidade do processo.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3831
Issue Date
2019


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