Efeito da Migalina sobre atividade inflamatória com diferentes estímulos em linhagens de macrófagos J774 e derivados de medula óssea


Abstract
Natural polyamines putrescine, spermine and spermidine are essential for cell growth and proliferation, protein and nucleic acid synthesis, cell matrix repair, adhesion and signaling processes. Mygalin was isolated from hemocytes of the spider Acanthoscurria gomesiana and identified as a bis-acylpolyamine analogue to spermidine, possessing microbicidal activity. Macrophages are innate immune response cells fundamental in the inflammatory process and are programmed to detect molecular patterns associated with pathogens. Immune cell surface molecules and cytokines are the key components for the achievement of the inflammatory response. Due to the limited knowledge of the role of Mygalin in the immune response, we investigated its immunomodulatory function in macrophages J774 and macrophages derived from C57BL / 6 mouse marrow MODM against several stimuli in different assays. The cells were either preincubated with Mygalin 40-160 μg/ml for 2 hours prior to stimulation or not with LPS 100 ng/ml, Toxoplasma gondii antigen 10-25-50 μg/ml, IFN-γ 1 ng/ml and Zimosan 10 μg/ml After 24 hours, hydrogen peroxide production was examined by the fluorimetric method with and without PMA (200 nM) and the alteration of the expression of the surface molecules by flow cytometry FACS. Supernatants from the J774 and MODM assays were harvested for quantify production of IL-12p40 ELISAand nitrite Griess. Treatment of cells with Mygalin and Toxoplasma gondii didn’t induce IL-12p40 and NO production. In J774 IFN-γ didn’t change the amount of NO in the control, but the LPS increased even in the presence of Mygalin and the same happened with LPS+IFN-γ. Zimosan increased NO production in J774, but IFN- γ reduced it. In MODM independent of the stimulus there was no alteration of the NO synthesis compared to control. Mygalin didn’t increase the production of IL-12p40 when the cells were stimulated by LPS and LPS+IFN-γ. Zimosan induced the synthesis of IL-12p40, but with IFN-γ the production reduced. We evaluated the effect of Mygalin on the production of hydrogen peroxide in MODM that Migalina reduced H2O2 production in the presence of PMA. Regarding the expression of CD11b: in J774 the LPS and LPS+IFN-γ decreased expression; F4 / 80: in MODM the LPS increased its synthesis; CD86: in J774 the LPS decreased expression even with IFN-γ, and in MODMall stimuli reduced synthesis even with Mygalin; CD284: no change in J774cells; CD206: LPS and LPS+IFN-γ there was a slight increase of the synthesis.The mechanisms involved are being analyzed for a better characterization ofthe role of macrolide in the macrophage.
Abstract in Portuguese
Poliaminas naturais (putrescina, espermina e espermidina) são fundamentais para o crescimento e proliferação celular, na síntese de proteínas e de ácidos nucleicos, reparação da matriz celular, adesão e processos de sinalização. A Migalina foi isolada de hemócitos da aranha Acanthoscurria gomesiana e identificada como uma bis-acilpoliamina análoga a espermidina, possuindo atividade microbicida. Macrófagos são células da resposta imune inata fundamentais no processo inflamatório e são programadas para detectar padrões moleculares associados a patógenos. Moléculas de superfície de células imunes e as citocinas são componentes fundamentais para a realização da resposta inflamatória. Devido ao limitado conhecimento do papel da Migalina na resposta imune investigamos sua função imunomoduladora em macrófagos J774 e macrófagos derivados de medula de camundongo C57BL/6 (MODM) frente a vários estímulos em diferentes ensaios. As células foram pré- incubadas ou não com Migalina (40-160 μg/mL) por 2 horas antes da estimulação ou não com LPS (100 ng/mL), antígeno de Toxoplasma gondii (10- 25-50 μg/mL), IFN-γ (1 ng/mL) e Zimosan (10 μg/mL). Após 24 horas, a produção de peróxido de hidrogênio foi examinada pelo método fluorimétrico com e sem PMA (200 nM) e a alteração da expressão de moléculas de superfície por meio de citometria de fluxo (FACS). Os sobrenadantes dos ensaios de J774 e MODM foram colhidos para análises de IL-12p40 (ELISA) e nitrito (Griess). O tratamento das células com Migalina e Toxoplasma gondii não induziu a produção IL-12p40 e de NO. Em J774 o IFN-γ não alterou a quantidade de NO do controle, mas o LPS aumentou mesmo na presença de Migalina e o mesmo ocorreu com LPS+IFN-γ. O Zimosan aumentou a produção de NO em J774, mas o IFN-γ a reduziu. Em MODM independente do estímulo não houve alteração da síntese de NO comparado ao controle. A Migalina não aumentou a produção de IL-12p40 quando as células foram estimuladas com LPS e LPS+IFN-γ. Zimosan induziu a síntese de IL-12p40, mas na presença de IFN-γ a produção reduziu. Avaliamos o efeito da Migalina na produção de peróxido de hidrogênio em MODM no qual a Migalina reduziu a produção de H2O2 na presença de PMA. Com relação à expressão de CD11b: em J774 o LPS e LPS+IFN-γ diminuiu a expressão; F4/80: em MODM LPS aumentou sua síntese; CD86: em J774 LPS diminuiu a expressão mesmo com IFN-γ e em MODM todos os estímulos reduziu a síntese mesmo com Migalina; CD284: sem alteração nas células J774; CD206: LPS e LPS+IFN-γ houve um leve aumento da síntese. Os mecanismos envolvidos estão sendo analisados para melhor caracterização do papel da Migalina em macrófagos.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3832
Issue Date
2019


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