Estudo da microfiltração de fluxo tangencial para a clarificação do caldo fermentado de Haemophilus influenzae tipo b


Abstract
Haemophilus influenzae type b (Hib) is a Gram-negative, facultative aerobic bacteria, responsible for respiratory infections, like pneumonia and meningitis, in children younger than 5 years. The main virulence factor of Hib is its capsular exopolysaccharide, Polyribosyl- Ribitol-Phosphate (PRP). Traditional PRP downstream processing comprises several steps of ethanol precipitation, centrifugation, ultracentrifugation, an also phenol extraction, resulting in a laborious, expensive and complex process. Therefore, a simpler and easily scalable process has been developed using tangential flow filtration (TFF) and ethanol precipitation steps. The aim of this work was to study the influence of the main variables during the microfiltration of the fermented broth for PRP recovery. Cell separation was performed at constant volume of 0.5 L, using a TFF system equipped with a Pellicon 2 Mini PVDF membrane (0.22 μm, 0.1 m2 ) and PBS pH 6.3 as dialysis buffer. Permeate flow was gradually increased during process, starting at 5 L.h-1.m-2 up to established values, in order to avoid membrane fouling. A full factorial experimental design was employed, in which three variables were combined at two levels, namely, TMP (15 and 30 psi), feed flow rate (400 and 500 L.h-1.m-2) and permeate flux (15 and 25 L.h-1.m-2), while temperature (22°C), PRP concentration (1 mg/mL), and broth volume/membrane area ratio (5 L/m2) remained constant. The effect of each variable was statistically evaluated by Analysis of Variance. The results indicate that TMP, feed flow, and permeate flow do not affect PRP retention by the membrane when evaluated independently. On the other hand, when combined on pairs or all simultaneously, these variables changed the PRP retention. The interaction between the higher experimental settings of TMP and feed flow or TMP and permeate flow increased PRP retention by around 8% and consequently reduced PRP recovery. Controlling these parameters is a promising strategy for the optimization of the broth clarification process, since the mean recovery observed in the trials was over 80%, in opposition to a mean recovery of around 60% obtained in former experiments.
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Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é uma bactéria Gram-negativa, aeróbia facultativa, responsável por infecções respiratórias, como pneumonia e meningite, em crianças menores de 5 anos. O principal fator de virulência do Hib é seu exopolissacarídeo capsular, Poliribosil- Ribitol-Fosfato (PRP). O processamento tradicional do PRP compreende várias etapas de precipitação com etanol, de centrifugação, de ultracentrifugação e de extração com fenol, resultando em um processo trabalhoso, caro e complexo. Desenvolveu-se, portanto, um processo mais simples e facilmente escalonável utilizando diversas etapas de filtração de fluxo tangencial (TFF), combinadas com etapas de precipitação com etanol. O objetivo deste trabalho foi estudar a influência das principais variáveis durante a microfiltração do caldo fermentado para a recuperação do PRP. A separação celular foi realizada a volume constante de 0,5 L, utilizando um sistema TFF equipado com uma membrana Pellicon 2 Mini PVDF (0,22 μm, 0,1 m2 ) e tampão fosfato salino pH 6,3 para a diálise. O fluxo de permeado foi gradualmente aumentado durante o processo, iniciando em 5 L.h-1.m-2 até valores estabelecidos, a fim de evitar o entupimento na membrana. Utilizou-se o delineamento experimental fatorial completo, no qual três variáveis foram combinadas em dois níveis: TMP (15 e 30 psi), fluxo de alimentação (400 e 500 L.h-1.m-2) e fluxo de permeado (15 e 25 L.h- 1 .m-2), enquanto a temperatura (22° C), a concentração de PRP (1 mg/mL) e a relação volume de caldo / área de membrana (5 L/m2) permaneceram constantes. O efeito das variáveis selecionadas foi avaliado estatisticamente pela Análise de Variância. Os resultados indicam que o fluxo de alimentação e o fluxo de permeado não afetam a retenção do PRP pela membrana quando avaliados de forma independente. Por outro lado, quando combinados em pares, essas variáveis alteraram a retenção do PRP. A interação entre as configurações experimentais mais altas de TMP e fluxo de alimentação aumentou a retenção de PRP em cerca de 8% e, consequentemente, reduziu a recuperação de PRP. O controle desses parâmetros é uma estratégia promissora para a otimização do processo de clarificação do caldo, uma vez que a recuperação média observada nos ensaios foi superior a 80%, contra uma recuperação média de cerca de 60% em experimentos anteriores.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3833
Issue Date
2019


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