Purificação de fatores de coagulação e imunoglobulinas a partir de plasma humano por cromatografia líquida


Abstract
In this work, we studied strategies for adsorption and desorption of FVII with NaCl gradient and with CaCl2 gradient in ANX Sepharose FF resin. The four-factor activated prothrombin complex concentrate contains factors II, VII, IX, and X and is indicated primarily for the treatment of type A or B haemophilia patients with inhibitors. We checked the possibility of producing it in the anion exchange column. The purification analysis was performed using chromogenic methods to determine the activity of coagulation factors, Bradford method for total protein dosage and 7.5% polyacrylamide gel. The results obtained indicate that the adsorption of FVII to the column and its desorption with NaCl gradient was possible, but it is still necessary to determine the experimental conditions for elution using CaCl2. We observed that the affinity of FVII to the anion exchange resin is lower than that of the FII and FIX factors, and can be purified separately from these proteins. This indicates that it is possible to obtain FVII alone, which is important, since activated FVII alone is also used in the treatment of hemophilia A and B with inhibitors. In order to obtain the 4-factor prothrombin complex, the obtained FVII can be added to the 3-factor prothrombin complex concentrate. We also studied the IgM separation of IgG and IgA by applying plasma directly to the Sepharose 4FF column. Purification of IgM is important because of its use in the treatment of autoimmune diseases, infections, neutralization of toxins, among other indications. IgG is separated from IgG and IgA, since IgG is also a biotechnological product and IgA, when present and preparations of other immuglobulins, can generate adverse reactions to the patient. Immunoglobulin dosing was performed by turbidimetry. The results of the purification indicate that the separation of the immunoglobulins was partial, as expected, but it will still be necessary to check the IgM elution profile in this purification.
Abstract in Portuguese
Neste trabalho estudamos estratégias para adsorção e para dessorção do FVII com gradiente de NaCl e com gradiente de CaCl2 na resina ANX Sepharose FF. O concentrado de complexo protrombínico ativado de quatro fatores contém fatores II, VII, IX e X e é indicado principal- mente para o tratamento de pacientes hemofílicos tipos A ou B com inibidores. Verificamos a possibilidade de produzi-lo na coluna de troca aniônica. A análise das purificações foi realiza- da através dos métodos cromogênico para determinar a atividade dos fatores de coagulação, método de Bradford para dosagem de proteínas totais e gel de poliacrilamida 7,5%. Os resul- tados obtidos indicam que foi possível a adsorção do FVII à coluna e sua dessorção com gra- diente de NaCl, mas é necessário ainda determinar as condições experimentais para eluição empregando CaCl2. Observamos que a afinidade de FVII à resina de troca aniônica é menor que a dos fatores FII e FIX, podendo ser purificada separada destas proteínas. Isto indica que é possível a obtenção de FVII isoladamente, o que é importante, pois, o FVII ativado por si só é utilizado também no tratamento de hemofilias A e B com inibidores. Para a obtenção do complexo protrombínico de 4-fatores, o FVII obtido pode ser adicionado ao concentrado de complexo protrombínico de 3-fatores.Estudamos também a separação de IgM das IgG e IgA aplicando plasma diretamente à coluna Sepharose 4FF. A purificação de IgM é importante devido sua utilização no tratamento de doenças autoimune, infecções, neutralização de toxi- nas, entre outras indicações. É necessária a separação da IgM das IgG e IgA, pois a IgG é também um produto biotecnológico e a IgA, quando presente e preparações das outras imu- noglobulinas pode gerar reações adversas ao paciente. A dosagem de imunoglobulinas foi realizada por turbidimetria. Os resultados da purificação indica que a separação das imuno- globulinas foi parcial, como esperado, porém será necessário ainda verificar o perfil de elui- ção de IgM nessa purificação.
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https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3847
Issue Date
2019


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