Obtenção do domínio proteico RBD do SARS-CoV-2 da variante Gama expresso em duas diferentes linhagens de Komagataella phaffii, em fermentador

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dc.contributorCurso de Especialização em Biotecnologia para Saúde – Vacinas e Biofármacospt_BR
dc.contributor(LBR) Lab. Biológicos Recombinantespt_BR
dc.contributor.advisorMartins, Elizabeth Angelica Lemept_BR
dc.contributor.authorGuimarães, Beatriz Miraspt_BR
dc.date.accessioned2023-08-25T18:15:39Z-
dc.date.available2023-08-25T18:15:39Z-
dc.date.issued2023pt_BR
dc.date.submitted2023-01-11-
dc.identifier.urihttps://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/5057-
dc.description.abstractBy the end of 2022, more than 5.3 billion doses of vaccines against COVID-19 had already been administered, however, the inequality in the distribution of these vaccines has as consequence the continuity of the virus circulation, favoring its evolution and given the origin of new variants that can evade the immunological protection conferred by the available vaccines. Therefore, it is necessary to generate alternative technologies to meet the demand for vaccines and protective therapies. Current vaccines are based on the Spike (S) protein, due to its importance in virus entry into cells and viral transmission, conferring its role as a target for antibody neutralization. The development of vaccines against the new variants focuses on the receptor binding domain (RBD) of the protein S to the host cell receptor. Recombinant protein-based vaccines are important because they can be manufactured inexpensively in large-scale production facilities using microbial hosts, such as Komagataella phaffii. This methylotrophic yeast can use methanol as a carbon source due to the presence of alcohol oxidase (AOX) enzyme genes. The strong AOX promoters are used in genetic construction for efficient expression of heterologous proteins. In order to obtain higher levels of production, it is desirable to use cultures at higher cell densities in fermenters, where it is possible to control the flow of methanol, which plays a key role in inducing the expression of the protein of interest. In this context, the main objective of our work was to obtain the RBD protein of the Gamma variant (RBDmut) of SARS-CoV-2 expressed in the GS115 and GlycoSwitch strains of Komagataella phaffii, evaluating the culture parameters that affect the metabolism of the microorganism and the expression. The tests were carried out in a 1 L fermenter with different methanol feed flows during 48 hours, the induction phase, monitoring temperature and dissolved oxygen. The RBDmut protein was recovered in the culture supernatant and purified by metal affinity chromatography, and the elution fractions were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. The results demonstrated a higher protein recovery in the culture submitted to a higher methanol feed flow, in a fraction drained after 26 hours of induction for both yeast strains. However, the expression of RBDmut in all cultures was lower when compared to previous cultures conducted in shaker, expressing the RBD of the original strain, Wuhan. These clones were generated using a much smaller plasmid, which suggests the insertion of a higher number of copies of the gene of the genoma of the yeast. This study contributed to point out several aspects to be considered in the generation of new recombinants of K. phaffii clones and for the determination of important parameters in the fermentation processes.pt_BR
dc.format.extent51 p.pt_BR
dc.language.isoPortuguesept_BR
dc.rightsRestricted accesspt_BR
dc.titleObtenção do domínio proteico RBD do SARS-CoV-2 da variante Gama expresso em duas diferentes linhagens de Komagataella phaffii, em fermentadorpt_BR
dc.typeAcademic monographpt_BR
dc.subject.keywordCOVID-19pt_BR
dc.subject.keywordKomagataella phaffiipt_BR
dc.subject.keywordfermentadorpt_BR
dc.subject.keywordlevedura metilotróficapt_BR
dc.subject.keywordKomagataella phaffiipt_BR
dc.subject.keywordfermenterpt_BR
dc.subject.keywordmethylotrophic yeastpt_BR
dc.contributor.butantanGuimarães, Beatriz Miras|:Aluno|:Curso de Especialização em Biotecnologia para Saúde – Vacinas e Biofármacospt_BR
dc.contributor.butantanMartins, Elizabeth Angelica Leme|:Pesquisador|:(LBR) Lab. Biológicos Recombinantespt_BR
dc.identifier.bvsccBR78.1pt_BR
dc.identifier.bvsdbIBProdpt_BR
dc.degree.levelEspecializaçãopt_BR
dc.degree.grantorEscola Superior de Ensino do Instituto Butantanpt_BR
dc.degree.localSão Paulopt_BR
dc.degree.programPrograma de Pós-graduação Lato Sensupt_BR
dc.description.abstractptAo final de 2022, já haviam sido administradas mais de 5,3 bilhões de doses de vacinas contra a COVID-19, entretanto, a inequidade na distribuição dessas vacinas tem como consequência a continuidade da circulação do vírus, favorecendo sua evolução e a origem de novas variantes que podem evadir da proteção imunológica conferida pelas vacinas disponíveis. Sendo assim é necessário a geração de tecnologias alternativas para suprir a demanda de vacinas e terapias de proteção. As vacinas atuais são baseadas na proteína Spike (S), devido a sua importância na entrada do vírus nas células e na transmissão viral, conferindo o seu papel como alvo para a neutralização por anticorpos. O desenvolvimento de vacinas contra as novas variantes foca no domínio de ligação da proteína S (RBD) ao receptor da célula hospedeira. Vacinas baseadas em proteínas recombinantes são importantes porque podem ser fabricadas a baixo custo, em instalações de produção em larga escala, usando hospedeiros microbianos, como Komagataella phaffii. Esta levedura metilotrófica pode utilizar o metanol como fonte de carbono devido a presença de genes de enzimas álcool oxidase (AOX). Os promotores fortes de AOX são utilizados na construção gênica para a expressão eficiente de proteínas heterólogas. A fim de se obter maiores níveis de produção é desejável utilizar cultivos em maiores densidades celulares em fermentadores, onde é possível controlar o fluxo de metanol que exerce papel chave na indução de expressão da proteína de interesse. Nesse contexto, o objetivo principal do nosso trabalho foi a obtenção da proteína RBD da variante Gamma (RBDmut) do SARS-CoV-2 expressa nas linhagens GS115 e GlycoSwitch de Komagataella phaffii, avaliando os parâmetros de cultivo que afetam o metabolismo do microrganismo e a expressão. Os ensaios foram conduzidos em fermentador de 1 L com diferentes fluxos de alimentação por metanol durante 48 horas, fase de indução, monitorando a temperatura e oxigênio dissolvido. A proteína RBDmut foi recuperada no sobrenadante dos cultivos, purificada por cromatografia de afinidade a metal e as frações de eluição foram analisadas por SDS-PAGE e Western Blot. Os resultados demonstraram uma maior recuperação da proteína no cultivo submetido a maior fluxo de alimentação por metanol, em uma fração drenada após 26 horas de indução para ambas as cepas da levedura. Entretanto, a expressão de RBDmut em todos os cultivos mostrou-se baixa quando comparado a cultivos anteriores conduzidos em shaker, expressando o RBD da cepa original, Wuhan. Estes clones foram construídos usando um plasmídeo bem menor, o que sugere a inserção de maior número de cópias do gene no genoma da levedura. Este estudo contribuiu para apontar vários aspectos a serem considerados na geração de novos clones de K. phaffii recombinantes e na determinação de parâmetros importantes nos processos fermentativos.pt_BR
item.languageiso639-1Portuguese-
item.fulltextSem Texto completo-
item.grantfulltextnone-
item.openairetypeAcademic monograph-
crisitem.author.dept#PLACEHOLDER_PARENT_METADATA_VALUE#-
crisitem.author.orcid#PLACEHOLDER_PARENT_METADATA_VALUE#-
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