Caracterização funcional da proteína LIC11903 de Leptospira interrogans contendo domínio Ig-like

Introdução: A leptospirose é considerada uma zoonose global, amplamente distribuída entre países em desenvolvimento. O agente etiológico desta patologia é a bactéria espiroqueta denominada Leptospira. Essas espiroquetas são morfologicamente finas, enroladas, helicoidal e móveis. O desafio da leptospirose está amplamente associado ao diagnóstico tardio, devido aos sintomas inespecíficos apresentados e à ausência de vacinas eficazes. As vacinas atualmente disponíveis para uso veterinário e humano são sorovares específicos e incapaz de gerar uma resposta imunológica de longo prazo. Proteínas presentes na membrana externa das leptospiras são alvos interessantes de estudo, devido à sua localização, que permite rápida interação com o hospedeiro. Objetivo: Assim, este estudo tem como objetivo caracterizar funcionalmente a proteína LIC11903 de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e seu domínio do tipo immunoglobulin (Ig)-like. Métodos: Foram realizadas análises de bioinformática para verificar a sequência conservada entre espécies de leptospiras, potencial localização celular, sítio de clivagem e domínios. O DNA genômico da cepa L. interrogans sorovar Copenhageni foi utilizado para obtenção dos fragmentos de interesse. O gene LIC11903 foi clonado da seguinte maneira: a sequência inteira da LIC11903 sem o peptídeo sinal, nomeado de fragmento total, uma porção não relacionada ao domínio, ao qual nos referimos como fragmento 1, e uma porção relacionada ao domínio Ig- like, nomeada de fragmento 2. Os produtos de interesse foram amplificados por PCR usando oligo nucleotídeos específicos. Cada fragmento e o vetor pET28a foram digeridos com as enzimas de restrição XhoI e EcoRI, purificados e inseridos no vetor pET28a. Os plasmídeos recombinantes foram propagados em uma cepa de Escherichia coli quimicamente competente (DH5α) e os clones positivos foram selecionados para verificar a presença do inserto por PCR de colônia. Os clones positivos foram selecionados e submetidos ao sequenciamento. Para análise da expressão genica, os plasmídeos recombinantes contendo os fragmentos de interesse foram transformados em diferentes cepas de E.coli (BL21 (DE3), C43 (DE3) e BL21 Star (DE3) pLysS), e induzidos com IPTG 1mM por 3h a 37oC. Por fim, as proteínas recombinantes obtidas foram purificadas por cromatografia de afinidade. Resultados: As análises de bioinformática identificaram a LIC11903 como uma possível lipoproteína contendo o domínio semelhante a Ig. Além disso sua sequência demonstrou ser conservada entre as espécies patogênicas e intermediárias de Leptospira. Os fragmentos foram amplificados por PCR apresentando o tamanho esperado de 861 360, 426 pares de bases, respectivamente para os fragmentos total, 1 e 2. A clonagem foi bem-sucedida e os clones positivos foram confirmados por sequenciamento. A LIC11903 e seus fragmentos foram expressos em todas as cepas de E.coli testadas, com exceção da cepa BL21 Star (DE3) pLysS que não demostrou expressão significativa do fragmento 1. Não foi possível obter uma quantidade significativa das proteínas recombinantes após a purificação. Conclusão: A clonagem e expressão da LIC11903 e seus fragmentos foram realizadas com sucesso, mas no processo de purificação algumas dificuldades foram encontradas para obter uma quantidade significativa de proteína. Assim, novos testes estão sendo executados para obtenção da proteína recombinante a fim de investigar o papel funcional LIC11903 na patogênese de Leptospira.terrestrial. It has the biggest geographic distribution from the gender occurring in all Brazilian biomes. Those lizards can be seen exposed to sun light during the summer, and at the winter they remain Hidden and inactive for a long time. Despite Salvator Merianae be a known species with a big distribution, its reproductive biology is not explored. This way was described the cycle and other aspects of the reproductive biology from males and females of this species through morphological and histological analysis from 86 Brazilian specimens. For this, were evaluated tissues collected from the vagina, ovaries, uterus and infundibulum from 26 female specimens, as well as testicles, epididymis, vas deferens and kidneys from 60 males specimens from safeguarded scientific collections. The samples were processed for histological analysis by Hematoxylin/Eosin (H/E) observed under light microscopy. The rostrum- cloacal length (RCL) variated from 85,44mm to 420mm in males and from 89,12mm to 360mm in females. At immature males the testicle was characterized by forming seminiferous tubules without lumen. The smallest sexually active male was collected in spring and presented the RCL from of 250mm. This specimen was at the beginning of spermatogenesis and the renal sexual segment (SSR) was not hypertrophied, because it had not yet received the hormonal induction of testosterone produced by the testis. The remaining adult male specimens collected in spring showed testicles at peak spermatogenesis, with observations of sperm in the epididymis and hypertrophied SSR. Most of the females was in primary vitellogenesis (v1). Only one specimen was in secondary vitellogenesis (v2), and one specimen had eggs, both collected in spring. Was also observed storage receptacles at the posterior infundibulum, although, without the presence of sperm. Those lizards present a seasonal reproductive cycle with a stage of active follicular development and spermatogenesis at the beginning of spring, the period of the year that copulation occurs.