Efeitos antitumorais do mastoparano e do peptídeo INKKI em modelos de melanomas experimentais “in vitro” e “in vivo”

O mastoparano (INLKALAALAKKIL) é um tetradecapeptídeo α-hélice e anfipático obtido do veneno da Vespula lewissi. O casoparano é um peptídeo catiônico (INKKI) isolado a partir da hidrólise da β-caseina bovina e apresenta motivo homólogo ao matoparano. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antitumoral “in vitro” e “in vivo” do mastoparano e do INKKI em modelo de melanoma experimental. A viabilidade foi avaliada em linhagens tumorais e não tumorigênicas através do método MTT. Adicionalmente, os efeitos do INKKI foram avaliados sobre a cinética de crescimento, adesão, migração e invasão celular em culturas de B16F10. O estudo das fases do ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo. A via de sinalização foi padronizada por Western blotting. Os modelos metastáticos e dorsais in vivo foram padronizados em animais C57BL/6 e em modelo NOD/SCID/γc null . Simultaneamente, a morte celular por apoptose induzida pelo mastoparano foi determinada pelo ensaio de Anexina V-FITC/PI. A perda do potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm) foi avaliada por citometria em células marcadas com sonda TMRE. A geração da espécie reativa de oxigênio (ROS) foi padronizada usando a sonda DHE. A fragmentação do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose e a condensação da cormatina foi analisada pela marcação nuclear com DAPI. O estudo in vivo foi padronizado sobre o modelo de melanoma dorsal. Os resultados mostraram que o mastoparano apresentou atividade citotóxica e o INKKI apresentou atividade antiproliferativa. Em adição, os dados mostraram que o INKKI foi capaz de inibir o crescimento celular, a adesão, a migração e invasão. Em complemento, a análise das proteínas mostraram redução nos níveis de GSK3β, N-caderina, fosfo Src Tyr 416 e fosfo FAK Tyr 925 e 397. A análise do ciclo celular mostrou que peptídeo INKKI foi capaz de aumentar a porcentagem da população na fase G1 e diminuição da proporção da fase S. Esses dados foram confirmados por Western blotting onde o tratamento mostrou redução nos níveis das ciclinas D1, D3, NFк-β e Erk1/2. Adicionalmente, os resultados dos ensaios in vivo mostraram que o INKKI reduziu a formação de metástases, inibiu o crescimento do melanoma cutâneo, aumentou a taxa de sobrevida, porém, não apresentou efeito em camundongos imunocomprometidos. Os resultados com o mastoparano mostraram que o peptídeo foi capaz de induzir aumento da população de células positivas para Anexina V. Além disso, induziu diminuição do potencial de membrana mitocondrial, aumentou a geração de ROS, induziu fragmentação do DNA e condensação da cromatina. Também, o mastoprano aumentou a expressão das caspases clivadas 3, 9 e 12, PARP, Bim, Bak, citocromo c, bem como redução da expressão de fosfo BAD 10 (S112), VDAC, PHB1 e Bcl-XL. Mais importante, o mastoparano reduziu o crescimento do melanoma cutâneo e aumentou a sobrevida. Em conclusão, o mastorparano e INKKI apresentam diferentes mecanismos de ação. O mastoparano induz morte celular através da via mitocondrial intrínseca e o peptídeo INKKI induz parada no ciclo celular. Nós também demonstramos que o INKKI teve um efeito antimetastático e inibiu o volume tumoral in vivo. O mastoparano apresentou efeito terapêutico in vivo.
Keywords
Mastoparano;  peptídeo INKKI;  efeito antitumoral in vivo;  parada do ciclo celular;  apoptose;  Mastoparan;  INKKI peptide;  in vivo antitumor effects;  cell cycle arrest;  apoptosis

Other Titles
Antitumor effects of mastoparan and INKKI peptide on “in vitro” and “in vivo” experimental model melanoma
metadata.dc.contributor
Document type
Doctoral dissertation
Advisor
Lebrun, Ivo
Level
Doutorado
Institution
Instituto Butantan
Place
São Paulo
Program
Programa de Pós-Graduação em Ciências – Toxinologia (PPGTOX)
Submission Date
2014
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