Prospecção das toxinas do veneno da aranha Phoneutria nigriventer

Translated title
Toxin prospection in the Phoneutria nigriventer spider venom

Publication type
Master's thesis
Language
Portuguese
Access rights
Open Access
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Abstract
Venoms of spiders pertaining to genus Phoneutria are complex mixtures capable of causing intense pain, spastic paralysis, autonomic dysfunction, convulsions, priapism, tachycardia, visual disturbances, fasciculation, itching and death. Several toxins are related to these effects and target many different receptors, representing an important source of new potential drugs for human and agricultural use. In this investigation crude venom was extracted, dried and stored at -20o C for investigation. Proteins were assayed by Bradford and nano-liter spectrophotometry. Electrophoretic profiling was performed with and without disulfide bond reduction. Bands obtained were cut off the gel and trypsin-digested as well as eluted and digested in solution for analysis by LC-MS/MS. Results were plotted against UNIPROT non-redundant database constrained to taxa Arachnida. Zimography evaluated proteolytic activity in the presence and absence of PMSF and EDTA demonstrating non- methalo- or serino-proteolytic activity in the range of 14kDa. Crude venom was fractionated by HPLC yielding 52 fractions. The positive identification of Tx2-6 and Tx3-4, both by pharmacological activity and MS suggested the integrity of the venom sample. Twenty of these fractions were toxic to mice i.p. injected. The usual signs were observed and these fractions were further submitted to HPLC purification. Only 21 of the more than 150 proteins estimated were identified in the database demonstrating that a more comprehensive proteomic approach is necessary.
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Venenos de aranhas do gênero Phoneutria são complexos e causam efeitos locais e sistêmicos, tais como intensa dor, paralisia espástica, disfunção autonômica, convulsões, priapismo, taquicardia, disturbos visuais, fasciculação, prurido e morte. Esses efeitos são ocasionados por toxinas específicas, direcionadas contra uma grande variedade de alvos farmacológicos, fazendo delas importantes agentes no estudo de novas moléculas com potencial aplicação na medicina e agricultura. Nesse estudo, o veneno da aranha P. nigriventer foi extraído, desidratado e armazenado a -20°C até os procedimentos experimentais. A quantificação das proteínas no veneno bruto foi realizada utilizando o reagente de Bradfort e as frações obtidas por cromatografia foram quantificadas através de um espectrofotômetro de nano volume. O perfil eletroforético do veneno foi analisado com e sem redução das pontes dissulfeto. As bandas obtidas foram recortadas e submetidas ao procedimento de digestão tripsínica assim como em solução, e subsequente análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) para identificação das proteínas correspondentes e comparadas no banco de sequencias não redundante UNIPROT. A atividade proteolítica do veneno da aranha P. nigriventer foi avaliada pela técnica de zimografia sem inibidores ou com PMSF ou EDTA. Observamos proteases na faixa de 14 kDa com intensa atividade gelatinolítica mas sem as características de metaloproteinase ou serinoproteinase, que ainda não foram devidamente estudadas. Em busca por novas moléculas presentes neste veneno submetemos o veneno bruto a fracionamento por HPLC e cerca de 52 picos foram obtidos. Avaliamos a integridade do veneno identificando duas toxinas conhecidas, a Tx3-4 e a Tx2-6 por espectrometria de massas (LC/ESI-MS) e observação dos efeitos após injeção em camundongos. Das 52 frações analisadas, cerca de 20 frações demonstraram atividade tóxica. Diferentes sintomas foram observados como prostração, diarreia, diminuição dos reflexos, alterações respiratórias, ereção peniana, letargia, hipersalivação, convulsão, agitação extrema, paralisia dos membros posteriores e morte de alguns animais. Todas as frações ativas foram submetidas à análise por espectrometria de massas. Apenas 21 dos mais de 150 peptídeos estimados foram identificados no banco de dados, mostrando que uma análise proteômica abrangente ainde sa faz necessária.
Reference
SOUZA JUNIOR, Tarcísio Liberato de. Prospecção das toxinas do veneno da aranha Phoneutria nigriventer. 2013. 109 p. Dissertação (Mestrado em Ciências - Toxinologia) - Instituto Butantan, São Paulo, 2013.
Souza Junior TL. Prospecção das toxinas do veneno da aranha Phoneutria nigriventer [Toxin prospection in the Phoneutria nigriventer spider venom] [Master's thesis]. São Paulo: Instituto Butantan; 2013. 109 p. Portuguese
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/3341
Issue Date
2013


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