Estudo dos efeitos desencadeados pelo veneno de Bothrops moojeni na síntese de mediadores inflamatórios em pré- adipócitos e os mecanismos envolvidos
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Butantan affiliation
Publication type
Master thesis
Language
Portuguese
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Abstract
Snakebites constitute an important public health problem, recognized by World
Health Organization. In Brazil, Bothrops genus snakes are responsible for the major
number of registered envenomation cases. Among this genus, the species B.
moojeni is known for the severity of local inflammatory response. However, systemic
repercussions of bothropic envenomation are still not well stablished. In this context,
adipose tissue is a metabolically active organ, known for producing many
proinflammatory mediators. Preadipocytes and adipocytes are important cell types
that constitute this tissue and possess the capacity of synthetize components that
drive to inflammation. Therefore, this study aims to investigate the effects of B.
moojeni whole venom (BmV), in cultured preadipocytes, with focus on: i) release of
cytokines and chemokines (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 and KC); ii) release of
prostaglandin E2 (PGE2); iii) protein expression of cyclooxygenase-1 and -2 (COX-1
and -2); iv) participation of COX-1, -2, and PGE2 receptors (EP1-4) on PGE2 release;
v) activation of transcription factor NF-κB; vi) participation of NF-κB on PGE2 release
and COX-2 protein expression; and vii) preadipocytes differentiation into mature
adipocytes. Moreover, the venom effects in adipocytes were investigated, focusing
on: i) PGE2 release and ii) COX-2 protein expression. In order to this, 3T3-L1
preadipocytes were cultured in DMEM medium, with 10% BFS, 1% L-glutamine and
antibiotics until confluence. Next, they were incubated with DMEM only, or TNF-α (20
ng/mL), or BmV (1 μg/mL) for different experimental periods of time. TNF-α, IL-6, IL-
10, MCP-1, KC and PGE2 concentration, in supernatants, was evaluated by ELISA.
COX-1, -2, and P-NF-κB protein expression was determined by Western blotting
analysis. COX-1, -2, EP1-4 receptors and NF-κB participation on PGE2 release were
evaluated utilizing pharmacological treatments with specific inhibitors and/or
antagonists. BmV effect on preadipocytes differentiation into mature adipocytes was
evaluated according to protocol previously described in literature. Taken together,
results obtained show that BmV activates proinflammatory pathways in
preadipocytes and mature adipocytes. This venom acts on these cells stimulating the
synthesis of cytokines that regulate inflammation (IL-6 and IL-10), or that possess
chemotactic activity (KC), besides PGE2. Moreover, BmV was capable of activating
mature adipocytes to PGE2 synthesis. In preadipocytes, COX-1 and -2 and EP1
receptor are important factors of venom-induced mechanisms involved in PGE2
release, with COX-2 protein expression increased in this process. It was also
demonstrated NF-κB participation in PGE2 synthesis by preadipocytes. Finally, BmV
is able to enhance preadipocytes differentiation into mature adipocytes. Taken
together, this work indicates that adipose tissue cells are targets for BmV and must
collaborate to the biosynthesis of inflammatory mediators involved in bothropic
envenoming pathophysiology.
Abstract in Portuguese
Os acidentes ofídicos constituem um importante problema de saúde pública,
reconhecido pela Organização Mundial da Saúde. No Brasil, as serpentes do gênero
Bothrops são responsáveis pelo maior número de envenenamentos registrados.
Dentro deste gênero, a espécie B. moojeni é conhecida pela gravidade da resposta
inflamatória exacerbada, no local da picada. No entanto, as repercussões sistêmicas
do envenenamento botrópico, em diferentes tecidos, ainda não são bem
estabelecidas. Neste contexto, o tecido adiposo é um órgão metabolicamente ativo,
conhecido por produzir diversos mediadores pró-inflamatórios. Os pré-adipócitos e
adipócitos são importantes tipos celulares que constituem este tecido e possuem a
capacidade de sintetizar componentes que conduzem à inflamação. Sendo assim, o
objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do veneno bruto de B. moojeni
(VBm), em pré-adipócitos, em cultura, quanto a: i) liberação de citocinas e
quimiocinas (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 e KC); ii) liberação de prostaglandina E2
(PGE2); iii) expressão proteica de ciclo-oxigenases-1 e -2 (COX-1 e -2); iv)
participação das COX-1 e -2, e dos receptores de PGE2 (EP1-4) na liberação de
PGE2; v) ativação do fator de transcrição NF-κB; vi) participação do NF-κB na
liberação de PGE2 e na expressão proteica de COX-2; e vii) diferenciação de pré-
adipócitos em adipócitos maduros. Ainda, o efeito do veneno em adipócitos foi
investigado quando à: i) liberação de PGE2 e ii) expressão proteica de COX-2. Pré-
adipócitos da linhagem 3T3-L1 foram cultivados em meio DMEM, contendo 10% de
SFB, 1% de L-glutamina e antibiótico até a confluência. Em seguida, foram
incubados com apenas DMEM, ou TNF-α (20 ng/mL), ou VBm (1 μg/mL) por
diferentes períodos de tempo experimentais. A concentração de TNF-α, IL-6, IL-10,
MCP-1 e KC, nos sobrenadantes, foi avaliada por ELISA. A expressão proteica de
COX-1 e -2 e P-NF-κB foi determinada por Western blotting. A participação das
COX-1 e -2, dos receptores EP1-4 e do NF-κB na liberação de PGE2 foi avaliada
utilizando-se inibidores e/ou antagonistas específicos. O efeito do VBm na
diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos maduros foi avaliada seguindo
protocolo descrito na literatura. Em conjunto, os resultados obtidos evidenciaram que
o VBm ativa vias pró-inflamatórias em pré-adipócitos e adipócitos maduros. Este
veneno atua sobre estas células estimulando a síntese de citocinas, que regulam a
inflamação (IL-6 e IL-10), ou possuem atividade quimiotáxica (KC), além de PGE2.
Além disso, o VBm foi capaz de ativar adipócitos maduros para a síntese de PGE2.
Em pré-adipócitos, as COX-1 e -2 e o receptor EP1 são fatores importantes nos
mecanismos desencadeados pelo veneno, que acarretam a liberação de PGE2,
sendo que a COX-2 tem sua expressão proteica aumentada neste processo.
Também foi demonstrada a participação do NF-κB na síntese de PGE2 em pré-
adipócitos. Por fim, o VBm é capaz de aumentar a diferenciação de PAds em adipócitos maduros, provavelmente através dos mecanismos antilipolíticos da PGE2. Em conclusão, este trabalho aponta que as células do tecido adiposo são alvos do VBm e devem colaborar para a biossíntese de mediadores inflamatórios, envolvidos na fisiopatologia do envenenamento botrópico.
Reference
MARQUES, Rodrigo Maia. Estudo dos efeitos desencadeados pelo veneno de
Bothrops moojeni na síntese de mediadores inflamatórios em pré-adipócitos e
os mecanismos envolvidos. 2021. 75 f. Dissertação (Mestrado em Ciências -
Toxinologia) – Instituto Butantan, São Paulo, 2021.
Link to cite this reference
https://repositorio.butantan.gov.br/handle/butantan/5392
Keywords
Issue Date
2021
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